超声波法提取山楂叶中总黄酮条件研究报告论文

-.z.本科生毕业设计〔论文〕题目：超声波法提取山楂叶中总黄酮的条件研究学生姓名：李友鹏刘浩刘高鹏学号：院系：化学工程学院专业年级：2011级应用化学3班指导教师：2015年6月12日-.z.摘要总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中别离出的最多的成效组分是黄酮类物质。利用超声波法，以芦丁为参照品，硝酸铝作显色剂，在510nm波长以分光光度法测定总黄酮含量。结果测得工作曲线的回归方程为A=0.0091C+0.0023，r=0.9980，a=0.0023，b=0.0091。线性相关系数R=0.9980。采用单因素考察法对不同提取溶媒、乙醇浓度、温度、时间、料液比进展总黄酮含量的测定，得出较佳的实验条件为：乙醇的体积分数为70%，料液比1:20、超声温度50℃，超声时间60min，此时得到的黄酮质量为g。通过四因素三水平的正交实验，得出影响总黄酮提取率的主要因素为乙醇浓度＞超声温度＞料液比＞超声时间。关键词：山楂叶；黄酮类化合物；超声波法；分光光度法ABSTRACTReferstothetotalflavones,itisakindsofnaturalproducts,widelye*istintheplantkingdom,ismanyeffectivecomponentsofChineseherbalmedicine.Hawthorncomple*chemicalcomposition,isolatedfromhawthornleavesmostoftheefficacyingredientisflavonoids.Thise*perimentusingultrasonicmethod，useRutinasreference，Aluminumnitrateaschromogenicagent。Thetotalcontentofflavonoidsbyspectrophotometryatthe510wavelength.TheresultsmeasuredtheregressionequationofworkingcurveforA=0.0091C+0.0023，r=0.9980，a=0.0023，b=0.0091。ThelinearcorrelationcoefficientR=0.9980.Bythemethodofsinglefactorinvestigation,differente*tractionsolvent,ethanolconcentration,temperature,time,andsolid-liquidratiotodeterminethecontentoftotalflavonoids.Thengetthebettere*perimentalconditionsfor:Thevolumefractionofethanol70%,Thematerial-waterratio1:20,Ultrasonictemperature50℃,Ultrasonictime60min,.Throughthefourfactorsthreelevelsorthogonale*perimentgetthatthemainfactorsinfluencingtheflavonoidse*tractionrateisethanolconcentration>ultrasonictemperature>solid-liquidratio>ultrasonictime.Keywords：Hawthornleaves;Flavonoids;Ultrasonicmethod;Spectrophotometry目录TOC\o"1-3"\h\u第一章绪论11.1研究背景11.1.1山楂叶的简介11.1.2山楂叶中黄酮类化合物11.1.3黄酮类化合物的研究现状31.2山楂叶中总黄酮的提取方法41.2.1水提法41.2.2浸渍法41.2.3微波提取法51.2.4酶解法51.2.5超临界流体萃取技术51.2.6超声波法51.3山楂叶中黄酮的测定方法61.3.1分光光度法61.3.2色谱法61.3.3纸色谱法71.3.4毛细管电泳法71.4总黄酮类化合物应用前景71.4.1抗心血管病药物71.4.2.抗肝脏毒药物81.4.3止咳平喘药81.4.4天然抗氧化剂81.4.5无公害农药81.4.6在食品行业中的应用81.5课题研究的目的、主要内容及其意义91.5.1课题研究的目的91.5.2课题研究的主要内容91.5.3课题研究的意义9第二章实验局部112.1实验原理112.2实验仪器与试剂112.2.1实验仪器112.2.2实验试剂122.2.3试剂的制备122.3分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量122.3.1芦丁对照品溶液的制备[30]122.3.2标准曲线的绘制122.3.3山楂叶中黄酮含量的测定132.4超声波提取工艺研究132.4.1提取溶媒的选择132.4.2超声波提取单因素试验142.4.3正交试验142.5精细度实验152.6稳定性试验152.7重复性实验15第三章实验结果与讨论173.1山楂叶中总黄酮含量的测定173.1.1适宜波长的选择173.1.2芦丁标准曲线的绘制183.2超声波提取工艺研究183.2.1提取溶媒的选择试验结果与讨论183.3超声波提取单因素实验19乙醇浓度对黄酮提取率的影响193.3.2料液比对总黄酮提取率的影响203.3.3提取时间对黄酮提取率的影响213.3.4提取温度对总黄酮提取率的影响223.4超声波提取正交实验233.5芦丁对照品精细度校准试验结果与讨论243.6稳定性试验结果与讨论253.7重复性试验结果与讨论26第四章结论27参考文献28致31附录A：开题报告32附录B：文献综述38-.z.第一章绪论研究背景山楂叶，中药名。为蔷薇科植物山里红或山楂的枯燥叶。夏、秋二季采收，晾干。分布于东北、华北等地。山楂是起源于我国的特产果树，有3000多年的栽培历史[1]。山楂叶为山楂的枯燥叶，含有多种化学成份，主要有黄酮和三萜两大类[2]。国内自20世纪50年代，就开场了对山楂叶的研究，随着中药提取和分析技术的现代化，山楂叶提取物的研究取得了很大的进展，其制剂益心酮片、胶囊、滴丸等已广泛应用于临床。药理及临床试验说明：山楂叶中黄酮类化合物具有降血压、调血脂、增加冠脉流量、改善心肌供血供氧等作用，对高血压、高血脂、冠心病及心绞痛等心血管疾病均具有显著疗效[3]。此外，山楂叶黄酮还具有抗氧化[4]、抑制肿瘤细胞增殖的作用[5]。山楂叶最正确采收期应为6月中旬至8月初，在山楂叶黄酮含量的顶峰期采集山楂叶，可充分利用资源，保证其收率和质量，提高利用价值。黄酮类化合物泛指两个苯环(A-环和B-环)，通过中央三碳链相互链接，从而行成的—系列C6-C3-C6化合物。主要指以2-苯基色原酮为母核的化合物,其根本构造为：2-苯基色原酮。山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中别离出的最多的成效组分是黄酮类物质，黄酮类化合物是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素，普遍存在于植物界中。山楂叶中的黄酮类化合物主要包括以下三大类：黄酮类、黄酮醇类和双氧黄酮类。山楂叶中黄酮类化合物的种类较多，其根本骨架是2-苯基色原酮(见图1-1)，不同之处是3号碳原子及苯环上取代基的种类和位置不同以及一吡酮环发生变化。山楂叶的抗氧化活性强弱与这些因素有关，只有分子构造满足一定条件时才能表现出较强的作用，其中最主要的是羟基化程度和羟基的位置，且一般认为β环中的邻二羰基起着主要作用，分子中酚羟基的数目或位置不同，彼此间的极性也不同，利用这一特性可以选择适当极性的溶剂系统来提取抗氧化活性较高的成分。图1-12-苯基色原酮(1)消除自由基和抗氧化活性自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合，转变成氧化物或过氧化物，使之丧失活性或变性，细胞功能发生障碍，引起机体逐渐衰老或病变。生物体内常见的自由基有：超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧自由基等。王毕妮等[6]的研究说明黄酮类化合物具有去除自由基和抗氧化活性的功能。研究显示：黄酮类化合物具有抑制自由基的生成、降低脂质过氧化[7]和刺激抗氧化酶的作用，其作用机理在于它能有效阻止自由基在体内产生的三个阶段[8]，即与超氧阴离子自由基反响阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止•OH的生成；与脂质过氧化基反响阻止脂质过氧化过程。(2)对酒精中毒的解毒作用和治疗酒依赖的作用酒的主要成分乙醇在代谢过程中产生大量乙醛，具有较强的毒性。进入人体内的乙醇大局部在十二指肠和空肠吸收，在体内代谢过程中产生过量的自由基，对生物膜造成严重的损伤，现代医学研究说明，酒精中毒可以引起NADH/NAD比值增高，造成肝脏纤维化或坏死，凋亡小体出现，乙醇脱氢酶改变等。大豆异黄酮对急性酒精中毒小鼠实验说明具有较好的解毒和抗氧化保护作用，能够拮抗乙醇对中枢神经的抑制作用，延长小鼠耐受酒精的时间；促进乙醇分解，降低血液乙醇浓度，加速乙醇的排泄；去除代谢过程中过量的自由基，保护肝细胞免受自由基亲电子化合物和毒物的损害[9]。(3)防癌抗癌作用Hussein等先后预测和发现了黄酮类化合物具有防癌抗癌作用。黄酮类化合物主要通过三种途径来到达防癌、抗癌的作用。即抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长和抗致癌因子等[10]。物理化学等致癌因子导致自由基在体内富集，引起脂质过氧化，破坏细胞的DNA从而引发癌症。黄酮类化合物是自由基猝灭剂和抗氧化剂，能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到防癌、抗癌的作用[11]。(4)抗肿瘤作用黄酮类化合物的抗菌和抗病毒作用已得到医学界的肯定，其抗肿瘤作用主要是通过诱导细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预细胞信号转导和促进抑癌基因表达等途径来实现[12]。尽管黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性时，均有A环与受体的负电荷中心结合、C环与受体的正电荷中心结合、其它局部通过氢键与受体发生作用的共性[13]，但因其苯环上取代基的不同而具有不同的抗肿瘤活性。如以不同糖基取代时，其抗肿瘤、抗氧化作用效果的差异就会很大。(5)抗心血管疾病黄酮类化合物具有抗心血管疾病的功能美国食品与药物管理局(FDA)于1999年10月就已将大豆异黄酮中的大豆蛋白推荐为降低血液中胆固醇浓度，以减少患心血管疾病危险的安康食品[14]。研究说明，黄酮类化合物可治疗心脑血管系统的一些疾病，有降血脂、胆固醇的作用，还具有抑制血栓和扩张冠状动脉等作用。可用于治疗高血压、动脉硬化。(6)抗骨质疏松黄酮类化合物可以用于治疗骨病和骨质疏松等症。其作用机理在于[15]：其一，它既可以抑制前列腺素E2(PGE2)的胶原蛋白合成增加，又能抑制PGE2的胶原蛋白合成减少，通过调节使其含量趋于平衡。因此可以用于治疗骨病；其次，它能提高甲状腺对雌激素的敏感性，使甲状腺C细胞分泌降钙素的作用加强，最终抑制骨再吸收而治疗骨质疏松症；其三，它还能抑制饮食中缺钙和维生素D引起的骨密度和骨钙含量的降低[16]。的研究现状祖国大陆山楂叶的应用研究始于20世纪，70年代至80年代中期进入了比拟系统的根底性研究。从90年代初至今在山楂叶应用方面取得了长足的进展。研究说明山楂叶中的活性物质主要为黄酮类化合物。王秉极[17]等采用硅胶柱色谱别离和旋转色谱别离，从北京山楂叶中别离一系列成分并进展了鉴定，分别是5,7-二羟基黄酮(柯因)、3,5,7-羟基黄酮、5,7-二羟基-2-甲氧基黄酮、二十三烷酸甲酯、邻苯二甲酸(2-乙基苯基)酯和癸二酸(2-乙基苯基)酯。迟家平等对辽宁西部产山楂叶进展了全面的研究，其中用加压硅胶柱层析等方法别离，并用核磁共振、质谱、红外、紫外等方法鉴定，从辽西山楂叶中别离出其中黄酮类化合物。周立东[18]等别离鉴定了北京山楂叶中的黄酮类成分，通过硅胶和聚酞胺柱别离，葡聚糖柱层析纯化，用核磁共振、质谱、红外、紫外和园二色谱等方法确定别离物构造，结果从北京山楂叶中别离到六种黄酮类化合物，分别是球松素、松属素、柯因、抽木柯因、良姜素和高良姜素，其中首次从北京山楂叶中发现球松素、松属素、袖木柯因、良姜素。王小平[19]等建立了分光光度法测定山楂叶中总黄酮含量，并对该方法进展了方法学考察。薛晓丽[20]将超临界CO2流体提取工艺与传统的乙醇浸出提取工艺相比拟，得出两种方法都有利于山楂叶有效化学成分的提取。乙醇浸出提取工艺有利于提取山楂叶中黄酮类物质，超临界CO2流体提取工艺有利于山楂叶中化学成分的分析的结论。郭志芳[21]釆用传统乙醇提取法和超临界CO2萃取法提取山楂叶有效成分，采用有机溶刻和桂胶柱层析对超临界萃取物的有效成分进展了别离分析，并釆用有机溶剂提取超临界萃取后的药渣中有效成分，发现峰胶乙醇提取物的总黄酮含量较高，超临界萃取后的药法仍含有较多的总黄酮。卢挺[22]等在优化实验条件和方法学测试的根底上，对我国山楂叶中的n种黄酮(金合欢素、芹菜素、肉桂酸、高良姜素、阿魏酸、橙皮昔、木犀草素、袖皮素、棚皮素、白黎芦醇和芦丁)用毛细管电泳法进展测定，检出了芦丁、芹菜素和棚皮素外的其他黄酮类化合物。2005年彭增[23]起等所做的研究，测定了存在山楂叶液体中类黄酮化合物的含量以及对山楂叶液体的抗氧化的能力大小也进展了测定。经现代科学分析，特别是近10年的研究证明，山楂叶所含有的丰富而独特的生物活性物质，使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能，对人体有着广泛的医疗、保健作用，是一种具有较高保健功能的产品。山楂叶中总黄酮的提取方法山楂叶提取物具有活血化瘀、宣通血脉、理气舒络之成效，是一种极具临床应用价值的功能成分。大量研究说明，黄酮类化合物是山楂叶提取物中主要生理活性成分之一。因此，近年来山楂叶黄酮的提取应用研究十分热门。将山楂叶枯燥粉碎，加水浸煮2~3次，冷却后粗滤，滤液离心别离再浓缩沉淀，过滤后真空枯燥得疏松固体。本方法操作简单，且不引入溶剂污染，生产的黄酮类化合物适用于配制山楂保健饮品，但产品纯度较低。浸渍法[24]是最为传统的提取方法，是利用一定量的溶剂，在一定温度下，将药材浸泡一定的时间，以提取药材成分。其根本流程[25]是：山楂叶—>除去杂质—>烘干粉碎—>水浸煮(2次)—>过滤—>滤液浓缩—>沉淀—>过滤—>滤液浓缩—>枯燥。用水浸提法生产黄酮，尽管黄酮的提取率稍低、提取液的杂质含量较高，但投资本钱低用水浸提法生产黄酮，尽管黄酮的提取率稍低、提取液的杂质含量较高，但投资本钱低、可操作性强，并且对环境的污染小，因此具有一定的工业化前景。张黎明[26]等人考察了山楂叶黄酮的水浸提法工艺。当微波加热时，细胞内极性物质尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物[27]。LL的果胶酶的复合酸液，在50℃、pH值为4.5的条件下将山楂叶酶解120min，再在90℃下浸提90min，总黄酮的提取率比常用方法提高了16.9%。1.2.5超临界流体萃取技术超临界流体萃取〔SCFE〕是指在超临界状态下，以超临界流体〔SFC〕为萃取剂，将一种成分〔萃取物〕从混合物〔基质〕中别离出来的技术。常用的萃取剂为CO2，价格低廉且无毒，还可以在近常温的条件下提取别离，能较好地保存有效成分，且无有机溶剂残留，但提取设备一次性投资较大。声波法超声波提取法[21]是利用超声波的空化作用，增强物质在溶剂中的溶解能力，加速和增加药材成分提取的一种浸提方法。其根本流程[28]是：取山楂叶，粉碎成粗粉，参加乙醇水溶液，然后在相应温度下超声提取一定的时间，过滤，滤渣重复提取，将提取液合并。超声提取法[29]所用溶剂量少，提取时间短，产率较高，在室温下便可进展，设备简单，操作方便，本钱小，是提取山楂叶黄酮的一种便捷高效的方法。吕帮玉[30]等人对影响超声波提取山楂叶黄酮的多个因子进展单因素和正交试验分析，得出超声波法的提取最正确条件为：采用70%乙醇浸提，料液比l:20，温度70℃，时间50min，超声2次，总黄酮的提取率高达98.87％。(1)可见分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进展定性和定量分析的方法。分光光度法测定山楂叶中的黄酮类化合物是以芦丁为标准品，利用黄酮类物质官能团中的3-OH或5-OH及邻二酚羟基与Al3+络合，形成黄色物质，再参加NaNO2生成红色，在430nm处有最大吸收峰。在一定浓度范围内，其浓度与吸光度值符合朗伯-比耳定律，总黄酮是一系列黄酮类物质的总和，可见光分光光度法测定总黄酮含量的根本原理是根据黄酮类物质母体功能性基团的特异性反响。该方法精细准确、操作简便，从而可以进展比色定量这是当前测定总黄酮所使用最为广泛的方法。(2)紫外分光光度法由苯甲酰基和桂皮酰基组成的穿插共捉体系存在于大多数黄酮类化合物分子中，其在吸收光谱200~400nm的区域范围内有两个紫外吸收带，峰带I(300~400nm)和峰带II(220~280nm)其中峰带II具有较强的吸收峰，可用紫外分光光度法直接在此特征吸收峰处对试验样品进展测定，从而确定黄酮含量。此法主要根据黄酮化合物自身的特点，无需使用任何显色剂。高红宁[31]等采用AB-8型号大孔吸附树脂精制苦参中苦参总黄酮。用紫外分光光度法测定得到苦参中总黄酮含量取得满意效果。杨红用聚醜胺前处理益寿胶囊样品后，以淫羊藿苷为对照，釆用紫外分光光度法，在270nm处测定吸收度得出山楂叶中总黄酮的含量。(1)高效液相色谱法高校液相色谱法是在经典的液相色谱根底上与气相色谱理论合并，并采用了高效固定相、高压粟和高灵敏度测器等技术。从而使其具有了别离效果明显，准确性好，分析快及仪器自动化程度高等优点。HPLC法分析黄酮类化合物常釆用反相C18色谱柱。FerasImadKanaze等釆用HPLC方法从W梧类药物原料与果汁中别离出了桔皮甘、橙皮苷和柚皮苷3种黄酮类化合物。M.Krauze-Baranowska等研究使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)从一些裸子植物树叶中别离出多种黄酮类化合物。刘文海[32]等通过使用反相液相色谱法(RP-HPLC)分析得出柚子内外皮中声丁的含量。(2)液相色谱与质谱联用法色谱与质谱联用(LC-MS)是一种新的检测技术，其中色谱是别离手段,质谱是检测手段。此方法对于繁杂样品的预处理要求不同，能够同时测定多种成分。检测的下限可到达pg、ng数量级。对于混合样品的分析具有很高的适应性、选择性和灵敏性、分析速度快、原料浪费减少，应用范围广。莲凌霄[33]等在高效液相色谱-质谱法测定大豆异黄酮含量的试验中，采用高效液相色谱法分析出大豆中含有的8种异黄酮成分，根据色谱峰的质谱特征别离鉴定出了各异黄酮。1.3.3纸色谱法纸色谱用于黄酮类分析检测，一般作为定性检测，采用高于临界胶束浓度(CMC)的十二烷基硫酸钠(SDS)，溴化十二烷基甲基卞胺水溶液作展开剂，通过纸色谱法别离和检测桑色素、杨梅黄素等8种黄酮苷和苷元，发现了适宜于别离其黄酮苷类的展开体系。但以此方法进展山楂叶中总黄酮测定时选择性和重现性较差。1.3.4毛细管电泳法毛细管电泳法几年用于分析天然产物得到较大的开展，科学家用毛细管电泳电化学检测法测定了葛根和葛藤中葛根素、大豆甙元和芦丁含量。毛细管电泳紫外检测法测定实验设备简单方便，价格合理、提取时间短、总黄酮含量较高，适用于山楂叶中黄酮类物质的取及少量生产提取。1.4总黄酮类化合物应用前景山楂叶中的主要活性物质是黄酮类化合物，黄酮类化合物的作用决定了山楂叶的应用领域。1.4.1抗心血管病药物黄酮类化合物在防止心脑血管疾病方面发挥了重要的作用。自80年代起，国内外先后研制开发了以银杏叶提取物制成的各种银杏制剂，内含24%的黄酮(主要由异鼠李素、山奈酚等组成)，适用于脑功能障碍，智力功能衰退，末梢血管血流障碍并伴随的肢体血液不畅。临床上用于治疗冠心病、心绞痛、脑血管疾病等均有良好的疗效[34]。利用山楂叶总黄酮开发的天然药品是治疗心绞痛、预防动脉粥样硬化、心肌堵塞、脑血栓的理想药物，对治疗心绞痛的总有效率为97.1%。此外利用山楂叶中的芸香甙、牡荆素等提取总黄酮制成"益心酮〞片，对治疗冠心病的总有效率为90%。1.4.2.抗肝脏毒药物从紫花水飞蓟种子中提取总黄酮，内含水飞蓟素、异水匕蓟素、次水飞蓟素是常用抗肝素药"益肝宁〞、"利肝隆〞以及国外"Silimarit〞的重要有效成分。具有刺激新的肝细胞形成，抗脂质过氧化作用，用于治疗肝炎、肝硬化，并能支持肝的自愈能力，改善安康状况[26]。1.4.3止咳平喘药80年代我国研制的124种防止气管炎的植物药中就有69种主成分是黄酮类化合物，包括黄酮醇、双氢黄酮及其甙，大多是较好的消炎、止咳、平喘活性成分。1.4.4天然抗氧化剂黄酮类化合物作为合成抗氧剂如BHT、BHA等替代品具有高效、低毒、廉价、易得的特点，日益受到重视。大量研究说明，茶多酚可以有效地抑制油脂的过氧化物形成和多烯脂肪酸的分解，从而延长了油脂的货架期。茶多酚已在保健食品、鱼油、食用油中得到广泛应用。如从法国桦树皮和葡萄籽中提取的总黄酮制成食用保健品"碧罗芷〞被美国FDA认可，经研究说明其具有较好的抗氧自由基作用，比VE强50倍，比VC强20倍，而且能通过血脑屏障，防止中枢神经系统的疾病[35]。1.4.5无公害农药化学合成农药的生产和使用日益受到环境和商业的压力，开发具有特异性功能、靶标专一性较平安的无公害农药显示了广阔的市场潜力。例如豆科植物中异黄酮类化合物，鱼藤酮(rotenone)及类鱼藤酮(rotenoids)均已制成植物类杀虫剂，在农业生产中得以广泛的使用[36]。1.4.6在食品行业中的应用随着食品工业的开展和消费水平的不断提高，人们越来越注重强身键体，改善饮食习惯，提高生活质量。于是保健食品以其天然性、食效性等特点在世界范围内成为人们追逐的目标。由于葛根黄酮的保健作用确有实效[37]，东南亚及欧美各国最近掀起以葛根黄酮为代表的开发应用热潮。据报道，国际市场上葛根黄酮含量40%的为300元/kg左右，含量达80%以上的为2500～4000元/kg，含量90%以上的为10000～15000元/kg。据不完全统计，2010年我国保健品市场销售额将达1000亿元。在众多的天然活性成分中黄酮类化合物是极有应用潜力的资源之一。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中，因此近十多年来各国科学家都积极关注着从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步加工成具有抗癌、抗衰老、调节内分泌等特异功能的保健食品和药品等产品。这些产品对于调节人体生理功能，提高生命运动质量，为食用者带来安康体魄。目前黄酮类化合物一般可采取如下两种利用方式：(1)直接应用含黄酮的植物提取液制成保健品食品；(2)将含黄酮的植物提取液经浓缩、分高纯化、枯燥等精制步骤，制取高纯度的黄酮类化合物。1.5课题研究的目的、主要内容及其意义1.5.1课题研究的目的山楂叶中的黄酮类化合物具有非常重要的药理性作用[38]。在人体生理学、病理学、药理学、中医药化学、药剂学等多种学科领域被涉及。为了可以更合理的开发利用这一珍贵资源，本课题通过提取山楂叶中黄酮以及测定山楂叶中总黄酮的含量的实验，确定较佳提取溶剂，提取方法和提取操作条件。为以后的更广泛的应用这一资源提供根底科学依据。1.5.2课题研究的主要内容本文用芦丁标准溶液做出标准曲线，采用可见光分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量，通过改变提取溶剂和提取方法，确定较佳的提取溶剂和提取方法。并对实验精细性、稳定性进展测定，并给出数据及分析。拟寻找出一种准确而简便的测定山楂叶中总黄酮含量的方法，为合理科学开发这一珍贵的中药资源，深入研究其确切的药理作用提供可靠的理论和实验依据。1.5.3课题研究的意义黄酮是山楂叶中的最主要的活性物质，经现代科学分析，具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能[39]，对人体有着广泛的医疗、保健作用，是一种具有较高保健功能的物质。因此，研究和开发山楂叶中类黄酮化合物成为研究热点，本课题探究提取和检测山楂叶中的黄酮具有重要意义。目前测定山楂叶中的黄酮的方法有：分光光度法，色谱法，纸色谱法，毛细管电泳法。上述各种方法各有各的优势，通过大量文献查阅比拟各种方法的优缺点，经小组讨论，用分光光度法测定山楂叶中黄酮含量较为经济且测量数据结果较为准确。分光光度法具有灵敏度高，选择性好，精细度和准确度较高，分析速度快，设备简单，操作方便等优点。分光光度法的应用范围广涉及化学化工、医疗卫生、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验[40]等各个方面，进展定性分析、定量测定、纯度检查、动力学研究等等。因此，利用分光度法检测山楂叶中的总黄酮含量具有重要意义。-.z.第二章实验局部测量山楂叶中的黄酮含量时，一般采用芦丁供试品做标准物质，因为芦丁具有与总黄酮相似的构造，在可见光区，两者的吸收峰相似，所以可用来测定总黄酮的含量。本实验以Al(NO3)3-NaNO2做显色试剂，用芦丁标准溶液绘制出标准曲线，得出回归线方程A=b*+a。测量山楂叶中的总黄酮的含量时，将所测得的吸光度带入回归方程，用以下公式进展计算得出总黄酮含量。(由比尔定律推导得出)(2-1)式中：A-吸光度C-样液中黄酮标定浓度，(μg/mL)a,b-由工作曲线求得随后进展芦丁供试品溶液精细度试验，利用不溶媒提取山楂叶中的黄酮，确定较佳的提取溶媒。通过用不同的方法提取山楂叶中的黄酮，确定较好的提取方法。通过改变提取操作条件确定适宜操作条件。然后进展精细性、稳定性和重复性试验。最后进展加样回收试验，计算黄酮含量。表2-1主要实验仪器仪器型号数量生产厂家可见光分光光度计722s1上海仪电分析仪器超声清洗仪*O-4200DT型1南京先欧仪器制造分析天平FA2004N1上海精细科学仪器循环水多用真空泵SFHB-3型1南京先欧仪器制造台式离心机80-2B型1上海安亭仪器厂真空枯燥箱ZK-82A型1上海市试验仪器总厂2.2.2实验试剂表2-2主要实验仪器试剂分子式分子量纯度生产厂家山楂叶///：杨村山楂园乙醇C2H5OH分析纯天津市科密欧化学试剂甲醇CH2OH分析纯天津市科密欧化学试剂亚硝酸钠NaNO2分析纯天津市巴斯夫化工硝酸铝Al(NO3)3分析纯天津市巴斯夫化工氢氧化钠Na(OH)分析纯天津市巴斯夫化工芦丁标准品C27H30O16·3H2O分析纯贵州迪大科技2.2.3试剂的制备(1)2溶液：在分析天平上称取5.0012g亚硝酸钠固体〔不含结晶水〕，加去离子水溶解，转移到100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(2)0.1g/mLAl(NO3)3溶液：在分析天平上称取9.9972g硝酸铝固体〔不含结晶水〕，加去离子水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(3)0.04g/mLNaOH溶液：在分析天平上称取4.0008g氢氧化钠固体〔分析纯〕，加去离子水溶解，转移到100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(4)60%甲醇：量取60mL无水甲醇于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(5)40%、50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇溶液：分别量取40mL，50mL，60mL，70mL，80mL，90mL无水乙醇于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。2.3分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量2.3.1芦丁对照品溶液的制备[30]精细称取105℃枯燥至恒重的芦丁标准品25.0007g置50mL容量瓶中，加无水乙醇适量，超声溶解，放冷恢复至室温，并用无水乙醇定容至刻度线，摇匀。精细量取上述液20mL，置于50mL的容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的芦丁对照品溶液，置于棕色瓶中待用。2.3.2标准曲线的绘制(1)芦丁标准液的制备2溶液2mL，摇匀，放置6min，再参加0.1g/mLAl〔NO3〕3溶液2mL和0.04g/mLNaOH溶液20mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置1h。(2)最大吸收波长的选取分别选取7组芦丁对照品溶液，用紫外-分光光度计在不同的波长下测定其吸光度，选取最大的吸收波长。(3)吸光度的测量待芦丁标准溶液与空白液静置1h后，在波长为510nm处，以空白液为参比测出其吸光度。(4)标准曲线的绘制以总黄酮含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程。2.3.3山楂叶中黄酮含量的测定(1)样品处理取采摘的山楂叶，洗净，置于枯燥箱中烘干，将烘干的山楂叶用粉碎机粉碎，过60目筛，得山楂叶粗粉。(2)供试品溶液的制备准确称取1.0003g粗粉放入带塞的100mL三角瓶中，参加50%乙醇溶液50mL在60℃下，用40Hz超声波提取40min，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液，准确移取提取液10mL，置100mL2溶液2mL，摇匀，放置6min，再参加0.1g/mLAl〔NO3〕3溶液2mL和0.04g/mLNaOH溶液20mL，加水稀释至刻度，测定吸光度值。(3)吸光度的测量待供试品与空白液静置1h后，在波长为510nm处，以空白液为参比测定其吸光度值。2.4超声波提取工艺研究2.4.1提取溶媒的选择准确称取3份山楂叶粉末1.0000g，分别置于具塞锥形瓶中，分别在以下三种条件下超声处理：(1)70%乙醇，料液比1(g):20(mL)，温度70℃，时间50min。(2)60%甲醇，料液比1(g):20(mL)，温度70℃，时间40min。(3)水，料液比1(g):30(mL)，温度80℃，时间40min。分别进展抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，在波长510nm处测定不同溶媒提取液的吸光度。比拟数据结果，得较佳的提取溶媒。超声波提取单因素试验本论文中采用单因素法对超声波提取工艺进展研究。(1)乙醇浓度对黄酮提取率的影响准确称取1.000g山楂叶粉末，分别用浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇水溶液在50℃下，料液比(g/mL，下同)1:20，超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，测定其吸光值,得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。(2)料液比对总黄酮提取率的影响准确称取1.000g山楂叶粉末，60%乙醇在60℃下，料液比分别为1:12、1:16、1:20、1:24、1:28超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，测定其吸光值，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。(3)提取时间对总黄酮提取率的影响准确称取1.000g山楂叶粉末，60%乙醇在60℃下，料液比1:20，超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，测定其吸光值，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。(4)提取温度对总黄酮提取率的影响准确称取1.000g山楂叶粉末，60%乙醇，料液比(g/mL)1:20，分别在40、50、60、70、80℃下超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，测定其吸光值，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。选择乙醇浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)和超声时间(D)，进展4因素3水平正交试验，优选山楂叶中总黄酮的最正确超声提取工艺条件。实验条件如表2.3所示。表2.3正交试验编号A%Bg/mlC℃Dmin150%1:165040250%1:206050350%1:247060460%1:166060560%1:207040660%1:245050770%1:167050870%1:205060970%1:2460402.5精细度实验准确吸取芦丁对照品溶液3mL各5份，分别放置于50mL容量瓶中，分别加12mL95%乙醇使总体积到达15mL，然后参加质量分数10%的Al(NO3)3溶液2mL，静置10min，再参加质量分数5%的NaNO2溶2mL，静置10min，最后参加质量分数4%的NaOH溶液20mL，静置10min，加水稀释至刻度，摇匀，静置45min后，以空白液作参比在510nm波长处测定吸光度。将试验所测吸光度带入回归方程，分别计算其中总黄酮的含量。2.6稳定性试验准确称取山楂叶粉末1.000g，置于锥形瓶中，在温度50℃料液比1:20条件下超声提取60min，过滤得样品滤液。供试品溶液的制备及空白试验，分别按照步骤2.3.2下的流程，以空白试液为参比，在波长510nm处每隔20min测定一次吸光度。2.7重复性实验准确称取山楂叶粉末1.000g，置于锥形瓶中，在70%乙醇溶液中，温度50℃料液比1:20条件下超声提取60min，过滤得样品滤液。6份供试品溶液的制备及空白试验，分别按照步骤2.3.2下的流程，以空白试液为参比，在波长510nm处测定吸光度值，平行测定六次。-.z.第三章实验结果与讨论3.1山楂叶中总黄酮含量的测定3.1.1适宜波长的选择表3-1波长选择实验数据表波吸光度长编号450/nm470/nm490/nm500/nm510/nm530/nm550/nm570/nm590/nm1234567图3-1波长选择试验数据表从图3-1中可知在490nm、510nm、530nm处测得的吸光度均有较好的吸收峰，但是吸光度在0.2-1.0之间时所测数据较为准确，对于所有的分光光读计都是最准确的，超出范围后即使有标准曲线误差也会很大的。而在490nm、530nm时吸光度均超过了1.0，在此波长下测量值会有较大的偏差。而在510nm波长下，吸收强度较高，吸收峰比拟对称，这样的好处是仪器波长出现小的偏差时，吸收度变化不大。因此选择510nm作为适宜的波长来测量芦丁标准溶液的吸光度来绘制标准曲线。所测得的芦丁标准溶液的吸光度数据如表3-2所示：表3-2芦丁标准曲线数据编号浓度C/(μg/mL)吸光度A100234567根据表中数据绘制芦丁标准曲线：图3-2芦丁标准曲线如图3-2所示，以吸光度对体积浓度进展回归，得回归方程A=0.0091C+0.0023，r=0.9980。结果说明在芦丁浓度在70872-μg/mL范围内呈良好线性。3.2.1提取溶媒的选择试验结果与讨论黄酮类化合物为亲水性物质，易溶于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂中，也溶于水中。不同溶剂对山楂叶中有效成分黄酮的提取有较大的影响。考虑到丙酮本钱较高且含有有毒成份。故实验选用水、甲醇、乙醇作提比照提取溶媒。所测得的实验结果如表3-3所示。表3-3提取溶液的选择结果编号提取溶媒山楂叶质量(g)吸光度黄酮类浓度(ug/mL)黄酮类质量(mg)1水2乙醇3甲醇图3-3不同提取溶媒所提取滤液分光度比拟结果讨论：采用此3种溶剂进展总黄酮的提取，其中用乙醇、甲醇做提取溶媒利用的是有机物质中的相似相容原理。因为乙醇、甲醇都含有-OH键而且分子量接近。由图3-3可以看出，乙醇的提取率明显高于甲醇和水。水作为提取溶媒，虽然本钱低，但相比于乙醇，超声水浸提山楂叶中总黄酮的提取率过低。故本实验选择乙醇做提取溶剂。超声波提取单因素实验乙醇浓度对黄酮提取率的影响分别采用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇水溶液在对山楂叶中中的黄酮类化合物进展提取，所测得的结果如表3-4所示。表3-4乙醇浓度对黄酮提取率的影响编号乙醇浓度山楂叶质量(g)吸光度黄酮类浓度〔ug/mL〕黄酮类质量(mg)140%250%360%470%580%690%图3-4不同浓度乙醇对提取黄酮质量影响结果讨论：从图3-4可以看出，60%乙醇提取率最高，在乙醇浓度40%-60%时提取率随浓度增加而升高。70%乙醇提取率略有下降，高浓度乙醇提取率反而下降。究其原因，可能是因为浓度低时溶剂还缺乏以能够进入叶片细胞将有效成分溶出，浓度高时乙醇会增加对脂类物质的溶解，以致降低了对黄酮类物质的提取效果。因此从提取率看，乙醇浓度应控制在50%-70%。3.3.2料液比对总黄酮提取率的影响准确称取1.000g粉碎后的山楂叶，60%乙醇在60℃下，料液比分别为1:12、1:16、1:20、1:24、1:28，超声提取40min，抽滤，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。所测得的结果如表3-5所示。表3-5料液比对总黄酮提取率的影响编号料液比〔g/mL〕山楂叶质量(g)吸光度黄酮类浓度〔ug/mL〕黄酮类质量(mg)11:1221:1631:2041:2451:28图3-5不同料液比对提取黄酮类质量的影响结果讨论：不同料液比对山楂叶总黄酮提取效果的影响以样品质量和溶剂体积的比值为料液比,不同料液比对山楂叶总黄酮的提取效果不同。由图3-5可以看出，参加样品的量一定时，随着溶剂量的增加，所提取的黄酮类质量不断升高，但是料液比超过1:24以后提取率增加幅度趋于平稳，从节约溶剂方面考虑,以选择1:20料液比为宜。3.3.3提取时间对黄酮提取率的影响，超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。所测得的结果如表3-6所示。表3-6超声时间对总黄酮提取率的影响编号超声时间〔min〕山楂叶质量(g)吸光度黄酮类浓度〔ug/mL〕黄酮类质量(mg)110min220min330min440min550min660min图3-6不同超声时间所提取滤液分光度比拟结果讨论：从图3-6看出，提取时间的长短也会影响黄酮得率。对叶片分别进展10、20、30、40、50、60min的超声波提取，可以看出，超声时间在10-50min时，随着超声时间的增加所提取黄酮类的质量也增加，50-60min提取的黄酮类质量变化趋于平缓，60min时提取效果最好，但考虑实验的时间问题，采用超声提取50min最为适宜。3.3.4提取温度对总黄酮提取率的影响准确称取山楂叶粉末，60%乙醇，料液比(g/mL)1:20，分别在40、50、60、70、80℃下超声提取40min，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。所测得的结果如表3-7所示。编号温度〔℃〕山楂叶质量(g)吸光度黄酮类浓度〔ug/mL〕黄酮类质量(mg)130240350460570表3-7提取温度对总黄酮提取率的影响图3-7不同温度所提取滤液分光度比拟结果讨论：从图3-7看出，超声温度对黄酮提取质量的影响较大。当温度在30-60℃时，随着温度的升高总黄酮提取率随之增大，60-70℃总黄酮提取率趋于平稳。因此原则60-70℃为宜。3.4超声波提取正交实验选择乙醇浓度〔A〕、料液比〔B〕、超声温度〔℃〕、超声时间〔D〕4因素3水平进展正交实验。结果分析见表3-8。表3-8正交实验数据编号A%Bg/mlC℃Dming吸光度黄酮类质量(mg)150%1:165040250%1:206050350%1:247060续表3-8编号A%Bg/mlC℃Dming吸光度黄酮类质量(mg)460%1:166060560%1:207040660%1:245050770%1:167050870%1:205060970%1:246040水平1：乙醇浓度50%，料液比1:16，温度50℃，时间40min。水平2：乙醇浓度60%，料液比1:20，温度60℃，时间50min。水平3：乙醇浓度:70%，料液比1:24，温度70℃，时间60min。表3-9正交实验极差分析编号A%Bg/mlC℃DminK1K2K3R结果讨论：从表3-8和3-9反响的实验数据及计算结果可知乙醇浓度极差最大，主次因素为A＞C＞B＞D。乙醇浓度对实验的影响最大其次是超声温度，料液比，最后是超声时间。3.5芦丁对照品精细度校准试验结果与讨论表3-10芦丁对照品精细度数据表样品编号吸光度〔A〕平均吸光度值〔A〕RSD%10.45%2345图3-8芦丁对照品精细度曲线图结果讨论：所得结果如表3-10和图3-8所示，计算所得芦丁对照品的平均吸光度值为0.432，所测的RSD%=0.45%，说明测得芦丁对照品精细度良好。3.6稳定性试验结果与讨论表3-11稳定性实验数据编号称样量〔g〕测定时间〔min〕吸光度〔A〕黄酮类质量(mg)102203404605806100图3-9稳定性试验数据图结果讨论：如表3-10和图3-9所示，放置时间对实验数据影响不大，在100min内，测定的吸光度变化不大。因此，放置时间对山楂叶中总黄酮含量的计算不会产生较大的误差。3.7重复性试验结果与讨论表3-12重复性实验数据编号称样量〔g〕吸光度〔A〕黄酮类质量(mg)平均质量RSD%10.89%23456结果讨论：进展重复性试验是用来考察这一实验操作是否具有可靠性，根据表3-11数据RSD%=0.89%，说明数据的精细度比拟好。做重复性实验时利用正交试验所得最正确提取条件(70%乙醇，料液比1:20，温度50℃，超声提取60min)，得到的数据稳定且精细度高。说明最正确提取条件的选择稳定合理。第四章结论1、本文以芦丁为对照品，用硝酸铝作显色剂，采用可见光分光光度计于510nm处测定吸光度，绘制了芦丁浓度-吸光度曲线，即标准曲线。得到回归方程A=0.0091C+0.0023，r=0.9980。精细度实验数据显示：RSD%=0.45，精细度良好。超声提取山楂叶中总黄酮常见溶媒中，乙醇效果最好，相对也最经济。影响总黄酮提取率的主要因素为乙醇浓度＞超声温度＞料液比＞超声时间。5、超声波法提取最正确条件为：70%乙醇，料液比1:20、温度50℃，超声时间60min，在此条件下所得到的总黄酮含量为。参考文献[1]李兴武，张黎黎．山楂的功能性成分研究进展[J]．农产食品科技，2010，4(2)：44-47．[2]秦猛，韩春英．山楂叶提取物的研究进展[J]．齐鲁药事，2009，28(9〕：542-545．[3]张元富，刘志辉，于行梅等．山楂叶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J]．制剂技术，2009，18(8)：42-43．[4]许瑞波，赵跃强，鲁升丽．山楂叶黄酮的超声提取、精制及抗氧化性研究[J]．食品研究与开发，2007，28(4〕：64-69．[5]唐世英，胡桂才，杨凤国等．山楂叶总黄酮对人类单核肿瘤细胞增殖的影响[J]．中药新药与临床药理，2010，21(3)：269-270．[6]国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．：人民卫生出版社，2010.[7]何改.山楂叶黄酮类化合物最正确提取工艺研究[J]．食品研究与开发，2002，23(1)：15-17．[8]邢小莉，杨玲．新疆药桑桑皮总黄酮提取工艺的优化[J]．中国酿造，2013，32(1)：57-60．[9]向东山．基于正交旋转组合设计的藤茶总黄酮提取工艺优化研究[J]．中国酿造，2010，29(2)：116-119．[10]赵翾，李红良，张惠妹．响应面法优化火麻仁黄酮提取工艺[J]．食品科学，2011(2)：127-131．[11]柳嘉，景浩．山楂黄酮提取物的抗氧化活性和对癌细胞生长抑制作用[J]．食品科学，2010(3)：220-223．[12]雷昌贵，孟宇竹，蔡利．柑橘皮中黄酮提取工艺研究[J]．中国食品添加剂，2008(2〕：135-138．[13]顾英，韩凤丽，王洪洋．响应面法优化红薯叶类黄酮提取工艺的研究[J]．食品工业科技，2012(3)：286-289，333．[14]余清，许慧星，肖小蓉等．基于响应面分析法优化的乌饭树叶总黄酮提取条件[J]．中国农学通报，2008(1)：93-97．[15]王昌禄，江慎华，陈志强等．香椿老叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性的研究[J].北京林业大学学报，2008(4)：28-33．[16]王兰珍，马希汉，王姝清等．元宝枫叶总黄酮提取方法研究[J]．西北林学院学报，1997(4)：66-69．[17]韩雅慧，顾赛麒，陶宁萍等．甘草总黄酮提取工艺及总抗氧化活性研究[J]．食品工业科技，2012(2)：239-242．[18]潘进权，张世英，何敏婷等．竹叶总黄酮提取工艺及抗氧化特性的研究[J]．中国食品学报，2012(3)：39-44．[19]曹纬国，刘志勤，邵云，陶燕铎等．黄酮类化合物药理作用的研究进展[J]．西北植物学报，2003(12)：46-49．[20]张氽，阚建全，陈宗道．生物类黄酮抗癌作用研究进展[J]．食品研究与开发．2003(03)．[21]李培培，戚向阳，罗彤等．化学发光法研究不同杨梅黄酮提取物的抗氧化活性[J]．中国食品学报，2011(7)：190-194．[22]王亚群，任永新．山楂叶的化学成分及其保健作用[J]．食品与药品，2006，8(12)：75-76.[23]KustenmacherH.Propolis[J].BerdtGes1991,21(1):65-92.[24]V.Bankova.PharmaceuticalandBiomecicalAnalysis[J].JournalofChemicalEcology1987,52(9-10):676-679.[25]V.Bankova.PharmaceuticalandBiomecicalAnalysis[J].JournalofChemicalEcology1996,slb:735-737.[26]Valcie.PharmaceuticalandBiomecicalAnalysis[J].JournalofChemicalEcology,56(4-5):269-272.[27]V.Uzel.PharmaceuticalandBiomecicalAnalysis[J].JouroynalofChemicalEcology,2005,160:189-195.[28]SuykensJ.A.K.,VanGestelT.,DeBrabanterJ.,etal.LeastSquaresSupportVectorMachines[C].WorldScientific:Singapore,2002.[29]徐颖，方金凤，顾岚．山楂叶黄酮去除自由基作用的研究[J]．食品工业，2008，1：23-25．[30]严德忠，于兰萍，王忠德等．山楂叶挥发油抗氧化性能及其成分研究[J]．天然产物研究与开发，2008，20(1)：82-86.[31]付中民，郑艳苹，杨文超等．山楂叶提取工艺的研究[J]．中国蜂业，2008，59(10)：26-29．[32]付中民，郑艳苹，杨文超等．山楂叶提取工艺的研究[J]．中国蜂业，2008，59(10)：26-29．[33]叶文峰，陈新．树叶中具有生理活性的黄酮类化合物研究进展[J]．江西师范大学学报，2000，8(24)：280-281．[34].张匀，栾雨时，张华微．甘薯叶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J]．食品研究与开发，2006，27(6)：92-94．[35]盛文胜，李标，夏晨燕等．微波-超声波提取山楂叶的工艺研究[J]．食品研究与开发，2008，29(10)：74-77．[36]闫磊，何再安，刘焱文.大孔树脂别离纯化山楂总黄酮的研究[J]．湖北中医学院，学报2007，9(2)：33-35．[37]张文，霍丹群.微波法提取山楂总黄酮的初步工艺研究[J]．中成药，2006，28(11)：1667-1669．[38]王立娟.微波辅助提取山楂叶总黄酮的条件研究[J]．林产化学与工业，2006，26(3)：131-134．[39]谢秀琼，周淑芳，韩丽.现代中药制剂新技术[M]．：化学工业出版社，2004：43-44．[40]王晓，李林波，马小来等.酶法提取山楂叶中总黄酮的研究[J]．食品工业科技，2002，23(3)：37-39．[41]张黎明，张小利.酶解-吸附澄清法提取山楂叶总黄酮的工艺研究[J]．化学工程，2007，35(8)：49-52．致本论文在教师指导下完成的。教师专业、严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严于律己、宽以待人的崇高风范，朴实无法、平易近人的人格魅力对本人影响深远。不仅使本人树立了远大的学习目标、掌握了根本的研究方法，还使本人明白了许多为人处事的道理。本次论文从选题到完成，每一步都是在导师的悉心指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢!在写论文的过程中，遇到了很多的问题，在教师的耐心指导下，问题都得以解决。所以在此，再次对教师道一声：教师，谢谢您!时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。离校日期已日趋渐进，毕业论文的完成也随之进入了尾声。从开场进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开教师、同学、朋友给我热情的帮助，在这里请承受我诚挚的谢意!在此我向化学工程学院教师表示感谢，谢谢你们四年栽培，谢谢你们在教学的同时更多的是传授我们做人的道理，谢谢四年你们孜孜不倦的教导!四年所收获的不仅仅是愈加丰厚的知识，更重要的是在阅读、实践中所培养的思维方式、表达能力和广阔视野。很庆幸这四年来我遇到了如此多的良师益友，无论在学习上、生活上，还是工作上，都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在一个充满温馨的环境中度过四年生活。感恩之情难以用言语量度，谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意。最后要感谢的是我的父母，他们不仅培养了我对中国传统文化的浓厚的兴趣，让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助。在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望!我一定会好好孝敬他们，报答他们!爸妈，我爱你们!"长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。〞这是我少年时最喜欢的诗句。就用这话作为这篇论文的一个结尾，也是一段生活的完毕。希望自己能够继续少年时的梦想，永不放弃。-.z.附录A：开题报告超声波法提取山楂叶中总黄酮的条件研究1课题研究的目的、主要内容及其意义1.1课题研究的目的山楂叶中的黄酮类化合物具有非常重要的药理性作用。在人体生理学、病理学、药理学、中医药化学、药剂学等多种学科领域被涉及。为了可以更合理的开发利用这一珍贵资源，为以后的更广泛的应用提供根底科学依据。本课题通过提取山楂叶中黄酮以及测定山楂叶中总黄酮的含量的实验，确定较佳提取溶媒，提取方法和实验操作条件。为以后的更广泛的应用这一资源提供根底科学依据。1.2课题研究的主要内容本文用芦丁标准溶液做出标准曲线，采用可见光分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量，通过改变提取溶媒和提取方法，确定较佳的提取溶媒和提取方法。并对实验精细性、稳定性进展测定，并给出数据及分析。拟寻找出一种准确而简便的测定山楂叶中总黄酮含量的方法，为合理科学开发这一珍贵的中药资源，深入研究其确切的药理作用提供可靠的理论和实验依据。1.3课题研究的意义黄酮是山楂叶中的最主要的活性物质，经现代科学分析，具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能，对人体有着广泛的医疗、保健作用，是一种具有较高保健功能的物质。因此，研究和开发山楂叶类黄酮化合物成为研究热点，本课题探究提取和检测山楂叶中的黄酮具有重要意义。目前测定山楂叶中的黄酮的方法有：分光光度法，毛细管电泳法，纸色谱法，高效液相色谱法，紫外区直接测定法，可见区络合法化学发光法。上述各种方法各有各的优势，通过大量文献查阅比拟各种方法的优缺点，经小组讨论，用分光光度法测定山楂叶中黄酮含量较为经济且测量数据结果较为准确。分光光度法具有灵敏度高，选择性好，精细度和准确度较高，分析速度快，设备简单，操作方便等优点。分光光度法的应用范围广涉及化学化工、医疗卫生、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进展定性分析、定量测定、纯度检查、动力学研究等等。因此，利用分光度法检测山楂叶中的总黄酮含量具有重要意义。2现有研究方法及现状2.1提取方法目前常用提取粗山楂叶中黄酮的方法如下：(1)醇溶法醇溶法是指用一定浓度的乙醇对山楂叶进展浸泡提取，每隔一段时间对其进展搅拌，提取一段时间，取上清液，剩余山楂叶滤渣用离心机进展离心，将离心所得的滤液和之前浸泡的上清夜进展合并后过滤，最后浓缩得到山楂叶浸膏。(2)微波辅助提取法微波提取技术是利用微波来提高提取率的新兴提取方法，相较于常规方法，微波辅助提取法选择性较高、提取效率高并且提取溶剂耗损少、操作中无噪音的产生比拟适合一些热不稳定物质的提取。(3)超声波辅助提取法目前超声波提取法己被人们广泛的使用，超声波提取是利用超声波的空化效应增加溶剂穿透力，在超声波空化粉碎的特殊作用下，细胞在溶媒中瞬间产生的空化泡崩溃而破裂，溶媒渗透到细胞内部，使细胞中的成分溶于溶剂之中。从而提高了药物溶出速度和溶出次数，增加物质成分的扩散，缩短提取时间，加速提取工程，增加提取效率。在提取山楂叶中的黄酮类化合物时，以超声波技术辅助醇溶法可以高效率的提取出山楂叶中的黄酮类化合物。相对于普通的提取方法，超声波辅助提取法能够减少提取所消耗的时间，同时能够增加提取物质的得率和不需要加热等优点。此法一般耗时十几分钟至一小时，具有省时、节能、提取率高等特点，推广应用价值非常高。(4)超临界CO2流体萃取法。通过这种提取方法所得的山楂叶颜色和味道都很良好。这种提取方法操作流程十分简单易行，提取时间较短。然而此法所使用的超临界提取设备价格昂贵，并且得率也相对较低。2.2检测方法目前，黄酮含量的测定方法有很多种，主要有以下