植物原生质体培养与体细胞杂交幻灯片

第七章植物原生质体培养与体细胞杂交

原生质体概括原生质体的培养体细胞杂交植物原生质体(protoplast)：植物细胞除去细胞壁后所剩下的部分。即是没有细胞壁的裸露细胞一、原生质体概况亚原生质体在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。核质体:由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体:不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。应用：1.体细胞杂交（somatichybridization）：实现远缘物种的体细胞杂交，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体2.遗传转化：实现外源DNA或细胞器的导入，通过植株再生就可以得到转基因植物3.分离细胞器的理想材料4.无性系变异及突变体的筛选植物原生质体研究进展1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。1968年，Takebeetal.首次获得烟草叶肉原生质体培养再生植株。1985年，Fujimuraetal.世界第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养获得再生植株。（一）原生质体的分离与收集

高产量、高质量的原生质体是进行原生质体培养和操作的前提。

步骤：

1.材料的选择；

2.酶解处理；

3.原生质体的分离、纯化；

4.原生质体的活力检测。1、材料的选择1）取材细胞分裂旺盛的材料双子叶植物：幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶单子叶植物（禾本科植物）：愈伤组织或悬浮细胞

2）预处理：有菌材料，必须进行表面消毒处理；暗处理；叶片萎蔫处理，撕去下表皮；质壁分离处理；悬浮细胞or愈伤组织预培养。2、酶解处理⑴配制酶解液⑵酶解⑴酶解液酶酶溶剂（膜稳定剂，pH稳定剂）渗透压稳定剂①

酶类植物细胞壁的主要成分：纤维素、半纤维素和果胶质（连接细胞中间层）分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶

酶Enzyme来源纤维素酶类Onozuka绿色木霉MeicelaseP绿色木霉Cellulysin绿色木霉DriselaseIrpexlutens果胶酶类Pectinase黑曲霉PectolyaseY-23日本黑曲霉MacerozymeR-10根霉半纤维素酶类RhozymeHP-150黑曲霉Hemicelluase黑曲霉成分用量（mg·L-1）KH2PO427.2KNO3101.0CaCl2·2H2O148.0MgSO4·7H2O246.0KI0.16BSA（牛血清白蛋白）MESpH=5.8②酶溶剂(CPW溶液:细胞-原生质体清洗液

)无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质体活力牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的破坏pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性。

③渗透压调节剂目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质体的活力和膜稳定性常用物质：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，要根据材料的特点来确定。酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用

⑵酶解将无菌材料放入酶解液中处理以释放出原生质体的过程原则：利用尽可能低的酶浓度和酶解时间获得大量而有活力的原始质体条件：材料与酶解液的比例为1g/10-20ml酶解液；一般在pH5.4~6.0、25-30℃、黑暗中振荡（30～50r/m）酶解30min~几十hours。苜蓿叶片的酶解法分离原生质体3、原生质体的收集与纯化⑴目的：除去未去壁的细胞、细胞碎片、叶绿体、微管成分和细胞团等组织残渣；残余酶液⑵预处理：酶解结束后，将酶解物通过孔径为20-70µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团，收集滤液于离心管中⑶纯化方法：沉降法：用甘露醇作渗透压调节剂和离心介质，将收集的滤液低速离心，使原生质体沉于管底漂浮法：用蔗糖作渗透压调节剂和离心介质，将收集的滤液提高速度离心，使原生质体漂浮于溶液表面，细胞碎片等杂质沉于管底界面法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片等杂质沉于管底。苜蓿叶片原生质体的纯化完整的原生质体苜蓿叶片的原生质体4、原生质体活力的测定荧光素双醋酸酯（fluoresceindiacetate，FDA）染色法原生质体活力（%）=发荧光的原生质体数/原生质体总数×100%FDA活细胞脂酶分解有极性荧光素积累紫外光照射绿色荧光胞质环流检测法：以胞质环流作为进行活跃代谢的指标（二）原生质体培养原生质体制备好后，用培养基将原生质体调至一定的密度（最低起始细胞密度以上），及时地进行培养。

1、培养基原生质体培养基基本上是参照植物组织或细胞培养所用的培养基。茄科植物：MS、NT十字花科和豆科：B5、KM8P禾本科：MS、N6、KM8P⑴无机盐：大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度低；由于Ca2+影响到膜的稳定性，因此较高『Ca2+』的对原生质体分裂有利。

⑵有机成分：原生质体培养时要求培养基丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、CM，YE，LH，CH、小牛血清等。成分数量（mg·L-1）成分数量（mg·L-1）成分数量（mg·L-1）NH4NO3600KNO31900KCL300MgSO4·7H2O300CaCL2·2H2O600KH2PO4170KI0.75H3BO33.00ZnSO4·7H2O2.00MnSO4·H2O10.00Na2MO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.025CoCL2·6H2O0.025NaFe·EDTA28葡萄糖68400甘露糖125蔗糖125鼠李糖125果糖125纤维二糖125核糖125山梨醇125木糖125甘露醇125丙酮酸钠5苹果酸10柠檬酸10延胡索酸10肌醇100生物素0.005尼克酰胺1氯化胆碱0.5盐酸吡哆醇1核黄酸0.1盐酸硫胺素10抗坏血酸1D-泛酸钙0.5维生素A0.005叶酸0.2维生素D30.005P-对氨基苯甲酸0.01维生素B120.01水解酪蛋白125椰子汁10

KM-8P（3）激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。⑷渗透压稳定剂：培养基中必须使用渗透压调节剂，以维持原生质体的稳定。等渗或者低于细胞内的渗透压（5）碳源----葡萄糖2、原生质体的培养方式：

⑴固体培养（平板培养）琼脂培养基与原生质体溶液混合摇匀，倒平板，薄层培养。特点：容易观察、统计原生质体的分裂情况，但操作比较复杂。进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度；平板培养在以后添加新鲜培养基和转移培养物方面也要复杂些。⑵液体浅层培养将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。特点：操作简单，对原生质体的损伤小，而且方便以后添加新鲜培养基和转移培养物原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间粘连，从而影响其进一步的生长、分裂原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。⑶液体—固体结合培养①液体浅层—固体平板培养双层培养法培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培养基中如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。

（4）琼脂糖珠培养：用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量的液体培养基进行振荡培养。特点：改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。3、培养条件⑴植板密度：104～105个/mL⑵散射光或黑暗⑶温度：25～30℃（三）原生质体的发育和植株再生原生质体→形成新的细胞壁→第一次分裂→小细胞团→愈伤组织→再生苗1细胞壁再生原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁2细胞分裂和生长在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。新细胞2-7d第一次分裂2w后多细胞的细胞团3w后小细胞克隆约6w后直径1mm的小愈伤组织低渗透压3植株再生将愈伤组织转移到分化培养基上继续培养。愈伤组织将通过形态发生的两条途径即器官发生或胚胎发生形成再生植株。

Plantregenerationfromleafprotoplastsofeveningprimrose

（夜来香）1d5d7d10d4周5周7周苜蓿原生质体分裂6weeksafterisolation8weeksafterisolation苜蓿原生质体形成细胞团苜蓿原生质体再生植株植物体细胞杂交（somatichybridization）又称为原生质体融合（protoplastfusion），指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。三体细胞杂交体细胞杂交主要集中以下植物 茄科植物 十字花科 禾本科 豆科体细胞杂交过程：原生质体的制备；原生质体的融合；杂种细胞的筛选和培养；杂种植株的再生和鉴定1、原生质体的制备2、原生质体的融合：自发融合：在原生质体分离过程中发生诱发融合：人为手段诱导原生质体融合的方法Protoplastfusion诱发融合物理融合化学融合NaNO3法高钙高PH法PEG法电融合微融合①PEG诱导融合法----1974，Kao等提出PEG即聚乙二醇，用于融合的PEG相对分子量一般在6000左右，是一种高效融合剂。优点：融合成本低，不需特殊设备；融合子产生的异核率高；融合过程不受物种限制缺点：融合过程繁琐；PEG可能对细胞有毒害主要步骤如下：①融合液配制②融合原生质体的密度和比例将两亲本A和B调整到1×104个/mL，并按1：1混合，静置2min后开始融合③融合向原生质体混合液中加入等体积的PEG诱导融合剂，轻轻摇匀后，放置10min。离心（100×g，10min），弃去上清液，用培养基悬浮原生质体。重复（３）２－４次，最后用培养基调至适当的密度培养（液体浅层培养、平板培养等）②高钙高pH法高钙高pH法诱导原生质体融合的步骤与PEG法基本相同，只是诱导剂是Ca2+浓度较高的强碱溶液，诱导融合时要保温（30-37℃）。③电融合法（