b第八章 基因治疗下课件

湖南科技大学生命科学学院基因工程第八章基因治疗（下）第八章基因治疗（下）一、基因治疗的策略和途径二、基因治疗的基本程序三、基因治疗的载体四、基因治疗的靶向性问题五、基因治疗的历史、现状和展望五、基因治疗的历史、现状和展望60年代Lederberg设想基因治疗遗传病。1980年，美国Cline主持了β－地中海贫血的基因治疗,引发社会风波。1980-1989年,

美国

Anderson为首的科学家争取社会和政府的支持理解，FDA和RAC制定了基因治疗审批管理方案。1989年,

美国Rosenberg经FDA批准主持肿瘤患者标志基因转移临床试验。1990年,美国Culver/Blease主持世界首例ADA缺乏症基因治疗临床试验。（一）基因治疗的历史回顾基因治疗从1989年进入临床试验以来,从相对禁锢到迅速发展,过热泛滥,反思降温,平稳发展,猛烈抨击,捷报频传等阶段,几经波折,充分体现了新生事物发展规律。但是,无论基因治疗发展坎坷如何,科学家坚信,基因治疗是一场医学革命,在21世纪将真正走向临床,为人类造福。（二）基因治疗的现状

疾病名称临床方案%治疗患者%

癌症

27965245970

传染病

337.841212

单基因病

55133069.0

基因标记

409.42276.5

志愿者

20.560.2

其它

163.8661.9

总计

4253476（二）基因治疗的现状基因治疗载体临床方案患者数量反转录病毒1601222

反转录病毒细胞21420

腺病毒86534

腺相关病毒436

单纯疱疹病毒10Lipofection69+2+1757+3

裸DNA1671

电穿孔220

Poxvirus25130RNA130（二）基因治疗的现状遗传病基因治疗的两重性1.必要性:没有其他办法根治2.安全性:基因整合的遗传毒性;

重复治疗的复杂性伴随终生的考验;

发展缓慢!!呼吁:

科学价值>商业价值社会价值>商业价值宽松的环境（二）基因治疗的现状肿瘤基因治疗Gynecologicaltumors:breast,ovary,cervixNervoussystemtumors:glioblastoma,leptomen-ingealcarcinomatosis,glioma,astrocytoma,neuroblastomaGenito-urinarytumors:prostate,renalcarcinomaSkintumors:melanoma,Gastrointestinaltumors:colon,colorectal,livermetastases,post-hepatitislivercancer,pancreaticcancer

（二）基因治疗的现状HeadandnecktumorsLungtumors(adenocarcinoma,smallcellcancer,non-smallcellcancer)MesotheliomaHematologicalmalignancies(leukemias,lymphomas,GVHDriskafterABMTinleukemia,multiplemyeloma)Sarcomas

Germcellcancers（二）基因治疗的现状肿瘤基因治疗肿瘤基因治疗的几种策略1.手术为主,早期诊断更为重要2.生物辅助治疗的一种,贵族治疗3.恶性肿瘤的转移和复发是重点4.肿瘤的复杂性---基因治疗的个性化5.潜在商业价值巨大6.风险性:死马当作活马医7.疗效评价的科学性:综合治疗;复杂肿瘤背景;易打擦边球（二）基因治疗的现状肿瘤基因治疗的评价AIDS致病机制:

（1）病毒要向淋巴组织及外周血细胞播散；（2）病毒吸附于细胞受体，融合和遗传物质进入细胞；（3）病毒在细胞内复制；（4）CD4细胞功能和数目降低，CD8细胞功能丧失；（5）感染性病毒的释放和病毒感染的细胞数增加；

(6）病毒复制的增强导致致病变株的出现；

(7）CD4细胞数和功能的进一步降低；

(8）艾滋病形成。艾滋病是由HIV引起的一个后天获得性遗传疾病，HIV携带者并不表现出艾滋病的症状，阻断携带向艾滋病发展是基因治疗的优势。（二）基因治疗的现状基因治疗艾滋病免疫疗法:HIV-env激活CTL干扰素:IFN-a抑制HIV复制胞内免疫:突变的病毒基因,如VP16,P24,Rev细胞受体:CCR5作为靶位抗HIV感染治疗病毒抗体:中和病毒及包装,如HIV结构蛋白的基因工程单链抗体反义策略:潜力很大,包括反义RNA,反义DNA,核酶,反义诱导等联合治疗:HIV多变,鸡尾酒治疗奏效（二）基因治疗的现状基因治疗艾滋病基因治疗的临床试验以外,更多的是各种基因治疗基础研究。基因治疗临床取得成功的源头在基础研究。1.基因治疗载体研究:理化方法;病毒载体,新型载体,杂合载体;载体的靶向性;载体的调控表达。2.基因治疗范围拓宽:功能基因组研究为基因治疗病种的扩大提供了基础;为人类改造自我提供了更多的幻想空间。（二）基因治疗的现状基因治疗的基础研究基因治疗将来可能治疗运动员严重受伤的肌肉，骨折的大腿或膝盖。在动物实验中，基因治疗已成功的愈合了骨折的骨骼，而且使受伤的肌肉长得更加强壮。可以用来治疗目前技术无法治愈的严重受伤的关节和骨骼,韧带和肌腱,也有可能治疗如关节炎等关节疾病。这项研究人体实验已经处于早期阶段。（二）基因治疗的现状基因治疗身体创伤台湾中研院李英惠利用Ｃ／ＥＢＰ基因治疗来防止肥胖。可利用基因取代策略，把体内一个控制脂肪细胞发育因子取代成另一功能相似相互有别的因子,脂肪转变成高代谢活性的能量消耗,不影响人脂肪功能及正常代谢机能。这项基因治疗已在老鼠身上获得良好的效果，经过基因治疗者虽然美食保持苗条体型。该研究可望让人们吃得多、吃得好，不运动也不会增胖。其它治疗肥胖的策略:PCG-1,瘦素基因等。（二）基因治疗的现状基因治疗肥胖

临床上口腔白色念株菌（简称“白念”）感染日趋常见。且由于耐药性，治疗很困难。由涎腺合成并分泌至人唾液中一种富组多肽具有明显抗真菌功能，且对耐药株有效。“白念”患者的该多肽浓度低下的。AdcMVH3体外实验杀死病菌显著有效.大鼠体内实验表明，经颌下腺富组蛋白基因转移，其合成蛋白多分泌至唾液，从而可用来治疗相关的口腔疾病。（二）基因治疗的现状基因治疗口腔感染美国宾夕法尼亚州大学成功发明新的基因治疗法，能够防止老鼠的肌肉老化,使肌肉不致因年纪而失去力量和萎缩。人类到了五十岁以後，肌肉的功能会每十年退化10%,IGF-I蛋白质刺激肌肉生长，补充已损坏的肌肉细胞；利用基因治疗，使肌肉继续制造IGF-I蛋白质,实验证实，老鼠经过基因治疗後，肌肉的功能增加百分之27%。（二）基因治疗的现状基因治疗肌肉老化用于美容:SOD,EGF,VEGF可望消除疤痕,延缓皮肤衰老；用于减肥:瘦素基因,能量代谢基因；治疗秃顶、促进毛囊增生:毛囊移植减少排异;“染”发:酪氨酸酶将白发变黑；延缓女性衰老,增加卵泡数、治疗不孕:通过激素调节基因可望实现；（二）基因治疗的现状研究中的基因治疗血友病B基因治疗:血友病是一种由于人凝血因子缺陷导致的遗传性出血疾病.1991年,复旦大学遗传学研究所采用反转录病毒介导的自体皮肤成纤维细胞对2例血友病B患者进行了世界首次血友病基因治疗临床试验,患者体内凝血因子浓度和活性上升,出血症状减轻,取得了安全有限的结果.1999年美国UP和Avigen公司合作采用AAV途径进行了血友病B基因治疗,患者治疗后出血症状显著改善。（二）基因治疗的现状基因治疗成功范例AdP53基因治疗肿瘤:P53基因突变与肿瘤发生发展高度相关,将正常P53基因导入肿瘤细胞,可以诱发肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无害。Clayman等采用AdP53治疗头颈部肿瘤取得良好效果,NemunaitisJ主持的AdP53治疗肺癌效果显著。AdP53基因治疗在美国已经进入临床III期试验,可望成为第一个基因治疗新药。我国也批准了该项基因治疗临床试验。（二）基因治疗的现状基因治疗成功范例HSV-TK自杀基因治疗:利用肿瘤细胞对HSV-TK基因/GCV的敏感性而自杀。这方面的基因治疗脑肿瘤开展较早,先后多种策略进入临床试验,取得了一定的疗效,并进入了临床III期试验。但是,由于RV的转移效率,GCV毒副作用等原因,推广有一定的困难。我国首例肿瘤基因治疗也采用此方法。（二）基因治疗的现状基因治疗成功范例心血管基因治疗:VEGF165对于血管的生成具有重要作用,而一些心脑血管疾病由于血管堵塞,狭窄导致,可以采用该策略进行血管再生,旁路再通,使病人免受开刀搭桥之苦。美国已经有多项方案进入临床试验,临床试验结果显示:新血管生长、心肌血流灌注和室壁功能改善，大多数病人的心绞痛减轻。该项研究具有立竿见影的惊人效果,商业价值巨大,被称为21世纪初最激动人心和快速发展的进展之一。但是也必须考虑到VEGF与肿瘤的关系。我国这方面的研究进入申请临床试验阶段。（二）基因治疗的现状基因治疗成功范例

法国科学家采用反转录病毒途径,以CD34+骨髓造血干细胞为靶细胞,对两例重症联合免疫缺乏症婴儿成功实施基因治疗,患儿不再服用任何药物就从隔离病房走向正常生活,机体免疫功能完全恢复,能够抵抗外界的各种病毒,细菌等病原体的感染。科学家称这是基因治疗取得完全成功的第一个报道。（二）基因治疗的现状基因治疗成功范例基因治疗一人死亡:1999年10月美国宾州大学JMWilson在开展腺病毒OTC基因治疗肝脏遗传病时,一位亚利桑那州的十八岁的青年Gelsinger接受了高剂量治疗后死亡。FDA调查:18点问题,知情同意,及时汇报;草率!FDA终止试验。媒体社会群起攻之;科学家保持沉默,内心呼吁理解。基因治疗前景?基因治疗是不是一场梦?（二）基因治疗的现状基因治疗存在的问题Gelsinger死后:美国专家委员会要求所有的基因治疗负面事件报告给NIH。RAC则要求建立公报基因治疗相关病或死亡的制度。1999年:970例负面报告(85严重)2000年464例负面报告(1-3月)(43严重),除宾大外,佛罗里达州的一例死亡可能是基因治疗所致,计死亡6人。至少另两个基因治疗中心已被关闭)。JeremyRifkin呼吁:暂停基治疗。未及时汇报和公布原因:隐私和行业秘密（二）基因治疗的现状基因治疗存在的问题国家“863”高技术计划自1987年起资助遗传病基因治疗;“八五”“九五”设重大,重点项目资助,国家自然科学基金也给予了面上及重点资助。中国基因治疗也跟随美国几经波折。1.复旦大学的血友病基因治疗中国第一,世界第二

脑肿瘤基因治疗:国际先进（二）基因治疗的现状我国的基因治疗研究2.上海肿瘤所---脑肿瘤/肝癌基因治疗HSV-TK脑肿瘤基因治疗临床试验肝癌靶向基因治疗申报临床3.第二军医大学:肿瘤免疫基因治疗细胞因子;DC细胞4.上海第二医科大学基因治疗中心同种异体瘤苗;细胞因子,免疫增强,血管生成及抑制;自杀基因,血友病A（二）基因治疗的现状我国的基因治疗研究中科院上海生化所:帕金森等神经系统基因治疗,TK,GDNF,脂质体,微囊移植上海儿童医院:地中海贫血反义及药物调控基因治疗北京中国医科院基础所:地中海贫血基因治疗:调控表达;转基因动物北京医科大学:心脑血管基因治疗北京中国预防医科院病毒所:新型病毒载体:AAV大规模扩增系统北京中国医科院肿瘤所:肿瘤基因治疗（二）基因治疗的现状我国的基因治疗研究基因治疗是一个涉及到基础研究与临床应用的跨学科工程。目前，多数临床试验项目都是由多家单位或企业合作进行的。不仅有基础与临床的合作，同时也有科研机构与企业的合作。多数用于临床试验的载体是由基础部门开发，然后由企业进行生产、制备后提供给临床的。从而使得基因治疗越来越接近或符合传统药物的生产制备与应用程序。因此，也更趋于科学与合理。（二）基因治疗的现状基因治疗的产业化世界上几家大的国际性制药公司都早已成立了基因治疗开发部，拆巨资投入基因治疗研究。如，BiogenInc.曾拆资3800万美元投入GenovoInc.,SandozLtd曾拆资2900万美元投入GeneticTherapyInc.进行基因治疗研究。而Ciba-GeigyLtd将21亿资产的49.9％的股份投入ChironCorp，从事基因治疗的开发。还有，像AvigenInc.,CellGenesys,IntroGene,MediGene以及Transgene等公司都是从事基因治疗研究与开发的。（二）基因治疗的现状基因治疗的产业化AvigenInc.AAVsystemHemophiliaB,A,Gaucher,lungdisease,blooddisease.Parkin-sonsdisease($140millionNASDAQ$35.0)TransgenefivevectorsfourPII,cooperatedwithHGSI,Schering-PloughInc.CTL:AdIL-2,IFN-r,Verocells,Ag:MucIbreastcancer,etc.HPV16,AdCFTR,DMD,cardiovasculardisease,(NASDAQ&NouveauMarche)TranskaryoticTherapiesInc.Non-viralexvivogenetherapyproducts:GA-EPO;hemophilia,GH($400million)（二）基因治疗的现状基因治疗的公司IntroGeneadenoviralvectorandstemcells(Crucell)

(Eruo50million)GeneTherapySystemsInc.DesignanddevelopsgenetherapyproductsQ-oneBiotechLtd.(UK)viralorplasmidforinvivoorexvivogenetherapyPI/IIVical:NakedDNAcompanyforcancer,DNAvaccinesandDNAproteindelivery.ChironCorp,CellGenesys,MediGene,Geneways,OxfordBioMedicaetc.（二）基因治疗的现状基因治疗的公司上海肿瘤研究所与天津天狮集团(2300万)合作进行脑肿瘤基因治疗临床试验。北京病毒所获得大连某企业5000万投资,开发新型病毒载体。上海第二军医大学获得华晨集团投资开展免疫基因治疗。深圳赛百诺公司从海外引进技术,开展腺病毒P53基因治疗进入临床试验。珠海丽珠集团,华北制药,山东金泰等公司投资北京医科大学开展心脑血管疾病基因治疗。（二）基因治疗的现状我国基因治疗的产业化基因治疗临床试验效果需要进一步确认,无可争议的疗效太少；期望值和现实相差太大；在遗传病基因治疗中忽视科学价值和样板作用基因转移效率低;基因表达水平低。基因表达持续时间短;基因转移缺乏靶向性;基因表达缺乏调控性;基因治疗的操作复杂;基因治疗的安全性(包括免疫)。缺乏足够的疾病治疗基因。缺乏有效的动物模型。

（二）基因治疗的现状基因治疗面临的问题1.大多重复国外同类实验；2.缺乏创新性各自为政,规模小,资金投入有限,缺乏中心的辐射作用；3.一哄而上,一哄而下,缺乏基因治疗正确认识.4.缺乏孵化和转化机制,更缺乏风险基金；5.基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学,免疫学,转基因动物,临床医学的结合不够；6.高级人才匮乏；7.重视商业价值,忽视科学价值和样板作用。（二）基因治疗的现状我国基因治疗存在的问题造血干细胞(HSC)是最为理想的靶细胞:HSC具有永生性的能力;HSC具有很强的增殖,分化和自我更新的能力(从1到10万);HSC产物直接进入血液;HSC从采集、分离、体外培养、扩增以及移植等技术路线已经成熟。（二）基因治疗的现状基因治疗研究的若干热点HSC特征及其面临的问题；HSC的获取，分离纯化；CD34+/38-;HSC培养和扩增:培养体系；短期培养；间质细胞共培养；探寻细胞分化抑制剂；反转录病毒(RV)是HSC目前最为理想的基因转移系统。小鼠造血干细胞已经取得20－30％的高效转移；而人HSC基因转移效率低于1％；原因：1.细胞表面反转录病毒受体数目差异；其次,5－Fu,Ara-C处理的区别。（二）基因治疗的现状基因治疗研究的若干热点提高RV对HSV的基因转移效率策略：刺激HSC增殖；提高RV受体表达；流动转导；纤维连接素(fibronection);GALV的env替换；腺相关病毒(AAV)因为在遗传病基因治疗中的独特优势而倍受亲睐。AAV基因转移HSC效率较低(复杂的机制,共受体)；AAV/SV40杂合病毒提高效率。基因治疗研究的若干热点（二）基因治疗的现状其它病毒载体:SV40病毒系统:高效感染HSC,最高达到90%,是其它病毒不能比拟.问题:整合?野毒污染.慢病毒(lentivirus):艾滋病的元凶-HIVRV的特性+有效转染非分裂细胞;具有T细胞的靶向性;HSC导向外膜蛋白的替换问题:安全性HSC基因治疗已经进入临床试验,取得成功,前景光明（二）基因治疗的现状基因治疗研究的若干热点近年来发展起来的新型基因治疗策略，是对人类某些特殊疾病现行基因治疗弊端所作的策略和对策上的调整。旨在通过产前基因转移，实现疾病的终身治愈。（二）基因治疗的现状宫内基因治疗（二）基因治疗的现状宫内基因治疗的优点避免某些遗传疾病产前造成的严重病损；旺盛的细胞分裂，有望获得更为高效的基因转移；免疫系统不成熟，减少或避免了机体免疫