素材：滤膜法测定微生物数量-高二下学期生物人教版选择性必修3

滤膜法测定微生物数量高中生物学选择性必修三介绍了稀释涂布平板法测定微生物数量，必修二介绍了血球计数板测定酵母数量菌。在科学研究和生产实践，还会用到一种定微生物数量的方法——滤膜法。人们在检查病原菌污染的饮用水、近海海水和水源水时，经常以检查水中大肠杆菌的数量作为指标（我国《生活饮用水卫生标准》规定：每升水中大肠杆菌不多于3个，可作为饮用水）来说明水受人畜粪便污染的程度。因水中由病人和病畜或带菌者的粪便污染而来的病原菌数量很少，不易直接检查，而水中的大肠杆菌群，如果超过一定数量，就说明被检查水可能有病菌存在。实际上这种检查过程，首先是应用选择性培养基，将大肠杆菌群从杂菌中分离出来的一种过程。其检验方法有两种：一是发酵法，即根据大肠杆菌群具有能分解乳糖生成CO2等气体的特性酶，而其他肠道细菌如沙门氏菌属，由于没有这种特性酶，不能产气，可被区别开来；另一种是滤膜法，它是利用细菌不能通过微孔性薄膜，在抽滤下液体滤过而细菌被截留在膜上，然后用具有高度选择性的品红亚硫酸钠培养基分离培养，本实验将应用这种方法分离鉴定大肠杆菌群。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基上培养→统计菌落数目．1.滤膜与滤器的灭菌（1）将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15分钟。前二次煮沸后需换水洗涤2-3次，以除去残留的溶剂。（2）滤器灭菌，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用纱布和牛皮纸包装好于121℃蒸汽下，高压灭菌20分钟2.分离培养（1）过滤水样（海水、饮用水、自来水，水库水及各种水源水），用灭菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，使粗糙面向上，贴放于已灭菌的滤器上，稳妥地固定好滤器，将水样注入滤器内，加盖，打开滤器阀门，在负0.4大气压下抽滤，水样抽完后，再抽气5秒钟，关上滤器阀门，取下滤器。（2）用灭菌摄于夹滤膜边缘，移放在EMB培养基平板培养基上，使滤膜的截留细菌面向上，另一面完全紧贴培养基，两者之间不得留有气泡，重复以上的步骤，再接种一、二个平板，倒置培养皿于37℃下培养20-24小时。（3）原理：大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基（EMB培养基）上长出的菌落呈黑色。3.含量（污染程度）的计算1毫升水样中的大肠杆菌群数等于滤膜上生长的大肠杆菌群的菌落平均数乘以稀释倍数，最后除以样品的毫升数，即得。例如，无菌操作下将90ml无菌水加入到10ml待测水样中，这样就将待测水样稀释了10倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数为45，黑色菌落为5，根据大肠杆菌鉴定的原理可知，黑色菌落为大肠杆菌，因此1升待测水样中的大肠杆菌数目=5×（1000÷10）=500个。例、测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基(EMB培养基)上培养→统计菌落数目。流程示意图如下图所示。其中，指示剂伊红美蓝可使大肠杆菌菌落呈现紫黑色。请据图回答问题：（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，其中需要进行灭菌处理的是

，与过滤有关的操作都要在

旁进行。（2）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的

操作。从物理状态角度分析，EMB培养基属于

培养基，从功能上分属于

培养基。（3）某生物兴趣小组的同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将10mL待测水样加入到90mL无菌水中，稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为124，紫黑色菌落数平均为31，则推测1L待测水样中的大肠杆菌数目为

。（4）大肠杆菌进行扩大培养时，用摇床振荡培养的目的是

。（5）在配制尿素培养基中，通过选用合适

的滤膜代替G6玻璃砂漏斗，也可去除尿素溶液中杂菌。答案：（1）滤杯、滤膜和滤瓶酒精灯火焰（2）接种固体鉴别（3）3100（4）提供氧气、使大肠杆菌与营养物质充分接触（5）孔径解析（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，其中需要进行灭菌处理的有滤杯、滤膜和滤瓶，与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌的污染。（2）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，可将滤膜上的菌体“复印”在培养基上，使其在培养基上生长，这属于微生物培养中的接种操作。从物理状态分析，EMB培养基属于固体培养基，从功能上分析，由于培养基上加有伊红美蓝，所以属于鉴别培养基。（3）在无菌操作下将10毫升待测水样加入到90毫升无菌水中，即稀释了10倍，稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为124，黑色菌落数平均为31，由于黑色菌落为大肠杆菌，所以可推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为3100个。