分子生物学-DNA复制与修复

第五章DNA复制与修复

DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。遗传信息传递的中心法则

生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNADNA的半保留复制第一节一、复制的规律半保留复制复制起始点/复制终止点/复制子/复制叉复制方向：单向复制、双向复制半不连续复制复制模式：眼型复制、θ型复制、σ型复制、D型复制DNA半保留复制的概念

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。以3‘→5’方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5‘→3’，这一条链被称为前导链(leadingstrand)。而以5‘→3’方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时其链的聚合方向与复制叉移动的方向相反，这条链是不连续合成的，称为随后链(laggingstrand)。半不连续复制：冈崎片段：

由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随后链的合成也是一段一段的。

DNA在复制时，由随后链先形成的一些短DNA片段称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。

(3）DNA解链酶(DNAhelicase)（4）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。(5）引物酶(peimase)和引发体(primosome)：启动RNA引物链的合成。

(6）DNA连接酶（DNAligase）二、原核生物DNA复制有关的酶类解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修复修复复制功能

1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）DNA聚合酶的功能：5’->3’聚合酶活性与延伸能力3’->5’外切酶活性与校对功能（保真性）5’->3’外切酶活性与切口平移切口平移法(nicktranslation)

：当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。同时该酶具有从5‘→3’的核酸外切酶活性,能从切口的5‘端除去核苷酸。切口平移的意义：切除RNA引物，并利用聚合酶活性填补缺口DNA修复中发挥重要作用DNA探针标记拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构DNA解链酶解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解链酶。单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

DNA连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链复制的起始：由下列两步构成（一）预引发

1．解旋解链，形成复制叉由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，拓扑异构酶和解链酶使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。三、DNA生物合成过程2．引发体组装其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。（二）引发在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

复制的延长

阶段（一）聚合子代DNA由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）复制的终止

阶段（一）去除引物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6

）DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）起始时以RNA为引物DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。起始时以RNA作为引物的作用

DNA聚合酶分子量亚基数细胞内分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多个细胞核～80%无120，000一个细胞核和线粒体2～15%无-400，000一个细胞核+10～25%5-3外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一个细胞核10～15%无真核生物的DNA聚合酶端粒DNA的复制第二节一、真核生物端粒的结构端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。人类端粒由5′TTAGGG3′的重复单位构成，长度在5～15kb范围。端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。

端粒结合蛋白有两种：一种与单链富含G的端粒DNA结合；另一种与双链的端粒DNA结合。前者在端粒末端提供帽状结构以稳定端粒；后者可能直接参与端粒长度平衡的维持，是端粒延伸的负调节因子。二、端粒的功能保护染色体末端：免于被修饰、降解和端粒酶的无限延伸防止染色体复制时末端丢失或形成不稳定结构决定细胞的寿命、起“生命的时钟”作用固定染色体位置：与核膜或核基质结合三、端粒的长度及末端复制问题端粒的长度在不同的细胞之间存在着差异胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度大于体细胞体外培养细胞端粒的长度随着细胞逐代相传而缩短，每复制一代即有50～200nt的DNA丢失端粒丢失到一定程度即失去对染色体的保护作用，细胞随之发生衰老和死亡人体细胞端粒的长度不一，存在着个体差异随着年龄的增长，端粒每年减少约15～40nt，最终细胞衰老。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度不随着细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限分裂的能力四、端粒酶问题：生殖细胞、胚胎细胞、肿瘤细胞具有无限增值能力，端粒是如何维持其长度的？体细胞为何会衰老死亡？端粒酶（telomerase）端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它以其自身RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶结构端粒酶RNA人类端粒酶RNA(hTR)在长约450个碱基的序列中，有一段长11个核苷酸的区域(5′-CUAACCCUAAC-3′)，与人端粒序列(TTAGGG)n互补端粒酶蛋白人类端粒酶蛋白有两种：TP1和TP2。其中TP1能与端粒酶RNA特异性结合；TP2和逆转录酶的结构相似，是端粒酶的催化亚单位，在肿瘤细胞端粒酶的激活中起关键作用。端粒合成的一种模型3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5´3´nAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTCCCCTnAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn进一步加工继续延伸DNA突变第四节

一、突变的概念指基因结构的任何改变不能恢复到损伤前的状态，形成了可以通过遗传的永久性改变，致使基因作用改变、表达产物改变、个体表型改变。二、突变的方式

分为：自发突变、诱发突变在自然条件下发生的突变叫自发突变由人工利用物理因素或化学药剂诱发的突变叫诱发突变。诱变剂的种类：碱基类似物(baseanalog)碱基修饰剂(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation)

三、突变的类型根据基因结构的改变方式：可分为点突变和移码突变两种类型。

根据遗传信息的改变：可以分为同义突变、错义突变和无义突变三种类型。突变型基因转变成野生型基因的过程叫回复突变。某一突变基因的表型