真菌感染与实验室诊断进展

关于真菌感染与实验室诊断进展第1页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五侵袭性真菌感染发展趋势

患者年龄的增高

广谱抗生素的应用

更多、更复杂的医疗手段（如移植等）

高强度细胞毒性治疗的应用

免疫抑制剂的应用

其它病因死亡率相对降低第2页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五Candida条件致病菌Aspergillus机会来了！念珠菌曲霉菌第3页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五条件致病真菌感染危险因素国外：血液系统肿瘤病人

—粒细胞减少

__骨髓移植器官移植ICUHIV感染

国内:广谱抗生素应用ICU皮质激素糖尿病静脉插管第4页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五脓毒血症的发病率+600%+300%+300%Martinetal,NEJM2003;348:1546第5页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五78798081828384858687888990919202468Aspergillusspp.Candidaspp.AllotherPrevalenceatAutopsy[%]Grolletal,JInfect1996;33:23-32.经尸检证实的侵袭性真菌感染第6页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五国内侵袭性真菌感染的发病情况中华医学杂志2003年3月第83卷第5期第7页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五2004-2008年中国5家中心的

念珠菌分布

百分比（％）真菌第8页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五侵袭性曲霉患者在血液科和ICU

最为常见流行病学1994-1999年法国一项前瞻性调查结果Cornetmetal.JHospinfect.2002;514:288-296第9页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五混合型真菌感染的发病率也逐年上升念珠菌/曲霉混合感染8％11％12％尸检检出率(%)1989-1993年1994-1998年1999-2003年ChamilosG,etal.Haematological.2006;91:986-989一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示第10页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五新近出现少见真菌尸检检出率也有所上升足放线菌镰刀菌0.2％0.9％0.4％0.7％0.7％1.4％尸检检出率(%)1989-1993年1994-1998年1999-2003年ChamilosG,etal.Haematological.2006;91:986-989一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示第11页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五EpidemiologyandOutcomesofCandidemiain2019PatientsClinicalInfectiousDiseases2009;48:1695–703美国PATH网络：侵袭性真菌病数据库念珠菌血症2019例(2004-2008)念珠菌血症菌种比例大部分患者为非粒缺患者(占92.7%)第12页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五EpidemiologyandOutcomeofInvasiveFungalInfectioninAdultHematopoieticStemCellTransplantRecipientsClinicalInfectiousDiseases2009;48:265–73JohnBartlett.2009ICAAC.美国PATH网络：侵袭性真菌病数据库成人HSCT患者的侵袭性真菌病(2004-2007)共234例患者发生250次侵袭性真菌感染(确诊或临床诊断)第13页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五真菌感染流行特点危险因素不断增多，发生率逐年增高白念珠菌仍然是最常见的致病菌非白念珠菌和霉菌不断增加曲霉已成为重要的致死真菌第14页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五曲霉感染:日益严重的问题曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌病原体虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡率仍达90%AndrioleVT.JAntimicrobChemother1999;44:151-162;GrollAHetal.AdvPharmacol1998;44:343-500;DenningDW.ClinInfectDis1998;26:781-805;AndrioleVT.CurrClinTopInfectDis1998;18:19-36;LinS-Jetal.ClinInfectDis2001;32:358-366;PatersonDL,SinghN.Medicine(Baltimore)1999;78:123-138.第15页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五深部真菌感染的诊断标准

EORTC/MSG2008修订版宿主因素临床特征病原学真菌镜检真菌培养组织病理学检查血清学检查方法（间接证据）

CSF隐球菌抗原阳性——确诊

GM-test,G-test——临床诊断ClinicalInfectiousDiseases2008;46第16页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五IFI诊断标准确诊:病人有感染的危险因素;有临床症状;微生物培养阳性;组织检测阳性;临床诊断:

病人有感染的危险因素;

高分辨CT出现阳性的影象特征.1-3-β-D葡聚糖试验(G试验)阳性.并值上升;

广谱抗生素应用无效;疑似:病人有感染的危险因素;有临床症状或微生物检测+第17页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五确诊符合下列1项即为有可靠的微生物学和/或组织病理学证据。肺活检标本真菌培养阳性和/或组织病理学检查病变组织中发现真菌；血培养、骨髓培养2次生长同一种酵母菌；血培养、骨髓培养生长双相型真菌；骨髓涂片发现双相型真菌。第18页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五临床希望能鉴别念珠菌或丝状真菌白色念珠菌或非白念曲霉菌或毛霉菌是否卡氏肺囊虫第19页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五

微生物实验室检查真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学

第20页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五

真菌标本镜检

最简单也是最有用的实验室诊断方法优点：简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，阴性结果不能排除诊断。采用不染色湿片如KOH涂片或Gram染色涂片。如在无菌体液的直接镜检中发现真菌，常可确立深部真菌病的诊断。第21页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五真菌直接涂片的诊断价值

有意义的涂片结果

机体内部标本如血液、腹水、CSF、脓肿穿刺液等

新鲜尿液见到大量菌丝及孢子

组织真菌涂片

直接镜检患者痰、喉或气管分泌物阳性率为10%到30%第22页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五真菌直接涂片的诊断价值诊断阳性率高BALF培养阳性率40％，涂片64％，涂片＋培养67％(AnnInternMed1997,29:535;RespirMed1992,86:243)快速:2-4hr可以报告结果有助于鉴别感染类型有隔菌丝：曲霉菌属唑类抗真菌药（伊曲康唑、伏立康唑）有效无隔菌丝：根毛霉属、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属两性霉素B敏感Thelancet,2003,3:230-240第23页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五真菌直接涂片的诊断价值肺毛霉菌病：真菌培养的阳性率不高怕“冷”组织匀浆可能会破坏毛霉菌，“假阴性”有时，直接涂片是唯一诊断手段诊断肺毛霉菌病的治疗价值首选肺叶切除次选两性霉素B（唑类抗真菌药无效）卡氏肺孢子菌：无法体外培养Thelancet,2003,3:230-240第24页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五

微生物培养技术有意义的真菌培养标本非经口痰标本非插管尿标本血液或其他无菌体液、(胆汁、胸腹水、脑脊液）第25页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五

微生物培养技术无菌部位采集的标本(如血,CSF、胸腹水、关节液等)中分离的任何酵母都必须鉴定到种，均有诊断意义。同一部位反复分离出同一菌种也具重要意义。从非无菌部位(粪、痰、咽拭等)分离到的条件致病菌(如白念珠菌)，如直接镜检大量菌丝(+)，须结合临床认定具致病性。第26页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五培养阳性率最高的丝状真菌曲霉菌属：185种，约20种被报道过，其中烟曲霉、黄曲霉是常见的致病菌可从痰、支气管灌洗液、血、脑脊液、角膜刮出物、外耳道、鼻窦、腹膜液、玻璃体中分离到烟曲霉黄曲霉第27页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五重要的真菌感染的表现表现念珠菌曲霉菌发热＋＋＋＋＋＋＋＋多发性关节炎＋＋－血脲素氮＋＋－皮肤损害＋＋－肝损害＋＋罕见窦道－＋＋呼吸系统－＋＋＋中枢系统稀少＋＋JohnR.Wingard，IDSA，2005第28页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五合理判断实验室的结果在无菌条件下获取的体液，如检测出真菌，应考虑到有侵入性真菌感染，可作为临床开始治疗真菌的充分依据。在腹腔中分离到既有细菌又有念珠菌时，只有当抗细菌治疗无效时才考虑抗真菌治疗。（高危患者则需要给予抗真菌治疗）。

第29页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五合理判断实验室的结果

尿液：未进行过泌尿系统操作，没有留置过尿管的病人，出现明显念珠菌尿，提示有血源性的肾感染。

注意：无糖尿病、泌尿生殖系统异常或没有肾移植的病人，如导尿管中出现念珠菌尿，但无临床症状，不治疗，应尽量除去假体材料或导管。第30页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五合理判断实验室的结果白色念珠菌是正常寄植菌，其临床意义与监测部位及集落形成的数量有关。粪白色念珠菌计数>105cfu/g或尿>105cfu/ml为致病性。其他念珠菌、隐球菌、曲霉菌等不属于正常菌群，一旦阳性并排除污染后即有意义。两个或两个以上非相邻解剖部位的播散性念珠菌感染较菌血症的危险性和死亡率均高。第31页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五呼吸道标本分离到真菌有意义吗?这是困扰临床医生的一个难题。分析该真菌的临床价值应该由临床医生和微生物专家共同完成，应结合病人基础病进行分析。第32页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五气道分泌物中分离出假丝酵母菌意义

人类口腔正常定植菌，正常人20％－55％痰中可分离出假丝酵母菌属

假丝酵母菌肺炎少见

–发病率大约0.23－4.5％

25例ICU患者的尸体解剖研究：

–10例（40％）假丝酵母菌培养阳性

–只有2例（8％）是真正的假丝酵母菌肺炎用肺泡灌洗液或毛刷作真菌计数,在24例>103cfu/ml无一例是念珠菌感染实验室报告会增加唑类药物的应用和耐药性。第33页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五痰和BAL检查的诊断意义

上气道念珠菌定植常见，气道分泌物（痰和BALF）培养阳性不能作为侵袭性感染的证据。

EORTC/MSG定义：

痰和BALF中丝状真菌和隐球菌镜检和培养阳性作为感染的微生物学证据，而念珠菌培养阳性（无论3次还是更多）只是定植。第34页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五镜检和培养方法敏感性低血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难

培养时间长

有些标本采集困难第35页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五近年来诊断的进展？

胸部CT扫描PulmonaryCTscan非培养微生物检查技术Non-culturebased第36页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五非培养诊断的方法简介真菌细胞壁成分（1-3）-β-D-葡聚糖检测（G试验）真菌抗原检查半乳甘露聚糖（galactomannan)抗原（GM)甘露聚糖(mannan)抗原隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）

真菌特异的代谢产物（D-阿拉伯糖醇）

真菌DNA的检测第37页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五（1-3）-β-D-葡聚糖检测第38页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五（1-3）-β-D-葡聚糖检测b1,6glucansb1,3PPLbilayerchitinergosterolb1,3glucansynthasemannoproteins真菌细胞壁成份，占50%以上其他微生物、动物及人的细胞不含该成份用于侵袭性真菌感染的早期诊断第39页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五BG检测的特点

可检测多种致病真菌感染念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等阳性结果代表存在侵袭性真菌感染真菌对数生长期释放量最大,可被体内葡聚糖酶降解。每周检测2次第40页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五定量测定1-3-β-D-葡聚糖的设备

MB-80微生物快速动态测定系统：主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等第41页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五MB-80微生物快速动态测定系统

快速定量检测深部真菌和内毒素，帮助临床早期诊断目前常规方法难以确诊的侵袭性真菌感染、革兰氏阴性菌感染。

可检测标本：

血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、腹水等第42页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五定量测定1-3-β-D-葡聚糖的原理凝固蛋白原凝固蛋白动态浊度法凝固酶凝固酶原活化因子G因子G1-3-β-D-葡聚糖全过程2小时内完成，可及时提供结果，指导临床第43页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五BG检测用于念珠菌血症

BG检测敏感度明显高于Mannan检测79.6%vs42%阳性早于血培养阳性和临床症状出现对于念珠菌血症,BG检测是首选检查Clin.Infect.Dis.2005.41:654–659.J.Clin.Microbiol.2005.43:5957–5962J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013第44页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五β-（1-3）-D-葡聚糖(BG)检测用于侵袭性曲霉感染（IPA)敏感度为55%-100%特异度为52%-100%对于确诊IPA，阳性率为85.7-100%高度可疑IPA，阳性率为52.4-66%Med.Mycol.2006.44:5163–5172J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013J.Clin.Microbiol.2005.43:299–305第45页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五β-D-葡聚糖（G试验）的价值

酵母菌、丝状真菌细胞壁成分；

用于对系统性真菌病的诊断筛查；不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属等；

不能检测：隐球菌和接合菌；

第46页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五β-D-葡聚糖（G试验）的价值

敏感性：63-100%；特异性：74-100%

美国大多数研究限于念珠菌菌血症

其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少

缺点：易引起假阳性（血液透析；接受血制品治疗等），而且无法区分真菌种类。动态监测可避免假阳性

第47页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五－D－葡聚糖（G试验）的缺陷标本采集不能鉴定何种真菌感染第48页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五－D－葡聚糖参考值健康人：<10pg/ml

可疑感染：10-20pg/ml深部真菌感染：>20pg/ml第49页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五关于G试验建议G试验临床应用

1明确诊断（抗真菌药物治疗前）

2治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）

3连续2次采血进行G试验第50页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五1.Sennetal.1,3-Beta-D-glucanantigenemiaforearlydiagnosisofIFIsinneutropenicpatientswithacuteleukemia.ClinicalInfectiousDiseases2008;46:878–852.Ostrosky-Zeichneretal.Multicenterclinicalevaluationofthe(1-3)beta-D-glucanassayasanaidtodiagnosisofFIs.ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654–9OMarchetti.NewDevelopmentsandChallengesinDiagnosticsofInvasiveFungalInfections.4thTrendsinMedicalMycology.Ostrosky-Zeichner等2,6中心Fungitell试剂盒(一次>60ug/ml)Senn等1,单中心WAKO试剂盒(两次连续>7pg/ml)真菌病类型主要为念珠菌病(确诊+临床诊断)非粒缺患者n=107念珠菌病+曲霉病(确诊+临床)粒缺患者n=30敏感度89%63%特异度80%96%阳性预测值87%79%阴性预测值81%91%1,3-β-D葡聚糖检测诊断

侵袭性真菌感染(G试验)第51页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五Ostrosky-Zeichneretal.Multicenterclinicalevaluationofthe(1-3)beta-D-glucanassayasanaidtodiagnosisofIFIs.ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654–91,3-β-D葡聚糖检测诊断

侵袭性真菌感染(G试验)全部念珠菌n=92白念n=36近平滑n=18热带n=11光滑n=26克柔n=3敏感度%82.683.372.290.980.8100.0G试验检测不同念珠菌属的敏感度近似（>60pg/ml,近平滑念珠菌稍低）G试验检测不同念珠菌属的敏感度（>60pg/ml）念珠菌n=92曲霉菌n=10隐球菌n=12镰刀菌n=3接合菌n=3敏感度%82.680.025.0100.00第52页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五曲霉菌半乳甘露聚（GM）曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原可以从血清、脑脊液、胸水、BALF检测到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高1ng/mlLatexagglutination：15ng/ml第53页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五半乳甘露聚糖检测诊断

侵袭性曲霉病(GM试验)Diagnosisofinvasiveaspergillosisusingagalactomannanassay-ameta-analysis.ClinInfectDis,2006;42:1417–27OMarchetti.NewDevelopmentsandChallengesinDiagnosticsofInvasiveFungalInfections.4thTrendsinMedicalMycology.1996-2005年27项研究的Meta分析患者类型样本量敏感度(95%CI)特异度(95%CI)恶性血液病296070%(62-77%)92%(90-93%)异基因HSCT90382%(70-90%)86%(83-88%)实体器官移植22422%-40%(3-60%)84%(78-88%)第54页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五支气管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖检测OMarchetti.

NewDevelopmentsandChallengesinDiagnosticsofInvasiveFungalInfections.4thTrendsinMedicalMycology.Galactomannaninbronchoalveolarlavagefluid-atoolfordiagnosingaspergillosisinICUpatients.AmJRespCritCareMed,2008;177:27-34ICU曲霉病患者诊断的有效工具BALGM阈值0.5敏感度88%特异度87%血GM阈值0.5敏感度42%特异度78%110例ICU患者纳入分析，其中中性粒细胞减少患者仅占22%第55页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五合适的判定折点：1.0,0.8,0.5?在儿童的应用价值？食物中的GM可以被吸收，假阳性？哌拉西林/他唑巴坦治疗，假阳性？非血液病患者应用不多抗真菌治疗对结果的影响？半乳甘露聚糖(GM)检测存在的问题第56页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五酵母菌、丝状真菌细胞壁成分不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属不能检测：隐球菌和接合菌美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册敏感性、特异性：90％左右－D－葡聚糖（G试验）的价值第57页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五两种试验敏感性、特异性相当都可以在早期诊断侵袭性曲霉病，但是－D－葡聚糖可能出现更早两者结合，可以互补弥补GM假阴性可能同样在粒细胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖(GM)与－D－葡聚糖（G试验）比较第58页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五PCRPCR技术用于诊断种特异-PCR非特异PCR杂交Standart"single""nested"PCR-EIA"Real-time"标本全血血浆血清BAL最低检测范围4-10cfu/ml25-100fgDNA原位杂交目的基因多拷贝基因第59页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五PCR过筛试验诊断IA每周监测2次—通用引物;确定采用巢式和实时定量;敏感性100%，特异性65%;早于临床症状2天，早于确诊9天；动态观察持续阴性可排除。Dr.MaschmeyerG.in2ndTrendsinMedicalMycology,23-26October2005,Berlin,Germany.第60页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五完成全基因序列测定的病原真菌白念珠菌等致病性念珠菌新生隐球菌粗球孢子菌烟曲霉、构巢曲霉等数种曲霉组织胞浆菌卡氏肺孢子菌第61页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期五突破方向对基因组序列和功能的了解，找出特异处改进目前方法，提高敏感性Real-timePCR多重PCR芯片技术其它特异抗原第62页，共67页，2022年，5月20日，17点20分，星期