综合设计性实验-化学抑杀菌剂的效果评价课件

化学抑杀菌剂的效果评价

实验汇报一、前言（一）实验目的自主设计方案，通过滤纸片法研究一些常用抗生素、中药复方剂、消毒剂和防腐剂的抑杀菌效果，掌握评价化学抑杀菌剂作用效果的方法。了解一些常用化学抑杀菌剂的作用机理以及效果差异。通过实验操作，进一步巩固已学习的微生物实验技能，学以致用。（二）实验原理1.抗生素的特点（1）作用机理的选择性抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素干扰细胞膜（破坏膜的选择透过性）：多粘菌素、杆菌肽抑制蛋白质合成：与核糖体50S亚基（氯霉素，红霉素）或30S亚基结合（卡那霉素、链霉素、四环素）抑制核酸合成：抑制DNA复制（丝裂霉素）抑制RNA转录或合成（放线菌素D、利福平）

抗菌效果：抑菌、杀菌和溶菌2.消毒剂

可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂，主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和周围环境中的微生物，不能用于活细胞或体内治疗用。

作用机理：蛋白质变性、损伤细胞膜、氧化作用3.防腐剂可以抑制微生物生长，但对人体或微生物的毒性较低的化学试剂。常用于皮肤、黏膜、伤口等处的防止感染，也可用于食品、饮料、药品的防腐。4.研究方法

可以通过扩散法（滤纸片法、牛津杯法）、比浊（测吸光值）等方法检测不同抑杀菌剂的作用。滤纸片法

适用条件——不易挥发的化学药剂测定抑菌圈直径大小，抑菌圈直径越大，该消毒剂的杀菌能力越强。

注意事项——滤纸片大小一致（6mm）、滤纸片吸附量一致（本实验采取浸泡法来保证滤纸片吸附量一致）、菌苔均匀。

比浊法

在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度呈反比，与光密度呈正比。而光密度或透光度可以通过光电池测出。通过对比不同抑菌剂作用的同一菌液的光密度或透光度而比较出不同抑菌剂的作用效果好坏。二、材料与方法（一）材料及试剂待测菌种：大肠杆菌（G-），白色葡萄球菌（G+）药剂消毒剂：龙胆紫（0.1%、0.05%）、碘酒（0.5%、0.25%）抗生素：氨苄青霉素(10、50、100μg/ml)；链霉素(10、25、50μg/ml)；卡那霉素(10、25、50μg/ml)；四环素(10、25、50μg/ml)中药：双黄连口服液原液、清热解毒口服液原液(二)实验方法滤纸片法：选几种药剂（及浓度）进行

无菌操作下将灭过菌且冷却至50℃左右的培养基倒入无菌培养皿（约15ml）。待其凝固后用移液枪移取0.1ml菌悬液，然后用无菌涂布棒将菌悬液涂布均匀，制成含菌平板，备用。在无菌条件下，将灭菌后直径为6mm的滤纸圆片在待测药剂中浸泡至少5min后取出，自然沥干后贴在含菌平板上，每皿放六片，以无菌水作对照，置于37℃培养箱中培养24h。用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值。

判定标准：

抑菌圈直径大于6mm者判定为有抑菌作用，无菌水对照组应无抑菌作用。2ml无菌生理盐水10ml无菌生理盐水药品(二)实验方法本实验采取滤纸片法，操作步骤如下：1.配制牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g、水1000mlpH7.0-7.2，121℃灭菌20min2.所需用品的灭菌及配制药剂稀释液3.制大肠杆菌、白色葡萄球菌菌悬液

用灭菌后的生理盐水稀释菌种并摇匀。注意：每次移液枪取菌液前均需摇匀。4.涂板用移液枪准确移取100ul菌液于培养基表面，用灭菌后的涂布棒将菌液涂抹均匀。5.贴浸有药剂的滤纸片

含药剂滤纸片贴到涂菌的平板表面，每浓度浸泡至少5min，每平板贴7片，中间为对照37℃培养16~20h6.测抑菌圈直径

大于滤纸片直径1mm以上的最低浓度视为最低抑杀菌浓度。实验结果与分析白葡萄球菌结果图大肠杆菌结果图不同浓度碘酒对大肠杆菌的抑制作用0.50%：9mm0.25%：8mm不同浓度碘酒对白葡萄球菌的抑制作用0.50%：8mm0.25%：10mm5、6、7（浓度依次增加）表现出不同浓度氨苄青霉素对白葡萄球菌的影响8、9、10（浓度一次增加）表现出不同浓度链霉素对白葡萄球菌生长的影响11、12、13（浓度依次增加）表现出不同浓度卡那霉素对大肠杆菌的影响14、15、16（浓度一次增加）表现出不同浓度四环素对大肠杆菌生长的影响大肠杆菌：在双黄连口服液原液中的平均直径：8mm清热解毒口服液原液中的平均直径：7mm白葡萄球菌：在双黄连口服液原液中的平均直径：7mm清热解毒口服液原液中的平均直径：7mm四、分析与讨论（一）实验分析1.同一药剂不同浓度对细菌的抑杀作用

从实验结果可以看出，低浓度的药剂对细菌抑杀效果不明显而随着浓度的增大其抑杀效果越来越明显。如，浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的氨苄青霉素对白色葡萄球菌抑杀作用的实验中三者抑菌圈直径分别为9mm、18mm、27mm。2.同一药剂对不同细菌的抑杀效果观察同一浓度的同一药剂对不同细菌的抑杀实验结果可以看出，同一浓度的同一药剂对不同细菌有不同的抑杀效果。如，0.10%的龙胆紫对大肠杆菌的抑菌圈平均直径为10mm，而对白色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为15mm；0.05%的龙胆紫对大肠杆菌的抑菌圈平均直径为7mm，表现为低敏感的效果，而对白色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为13mm，表现为中度敏感的效果。3．不同药剂对同一细菌的抑杀效果通过观察不同细菌对同一细菌抑杀作用的结果可以看出，不同细菌对同一细菌的抑杀效果是不同的。如，同样是50μg/ml的浓度，氨苄青霉素对白色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为18mm表现为高度敏感的抑杀作用，而链霉素对白色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为13mm表现为中度敏感的抑杀作用。四、分析与讨论（一）实验分析6.四环素对大肠杆菌的杀菌效果较弱，大于50ug/ml时对白色葡萄球菌的杀菌效果为强效。7.中药（双黄连口服液原液、清热解毒口服液）对大肠杆菌和白色葡萄球菌都是弱效的杀菌效果。

综上，大于50ug/ml的氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素对大肠杆菌有强效的杀菌效果。龙胆紫、大于50ug/ml的氨苄青霉素、卡那霉素、四环素度白色葡萄球菌有强效的杀菌效果。进一步筛选出，大于50ug/ml的氨苄青霉素、卡那霉素对大肠杆菌和白色葡萄球菌都有很强的杀菌效果。双黄连口服液：金银花、黄芩、连翘。辅料为蔗糖、香精等清热解毒口服液主要成分：石膏、知母、金银花、连翘、黄芩、栀子、龙胆、板蓝根、甜地丁、玄参、地黄、麦冬。辅料为蔗糖。（二）实验讨论（二）实验讨论2．细菌菌台的厚薄对抑杀实验结果的影响

通过观察实验现象可以看出，细菌菌台较薄的培养基内抑菌圈的大小相比于菌台厚薄适宜的培养基内抑菌圈大小均明显较大，但抑菌圈比较模糊。如链霉素对白色葡萄球菌抑杀实验中10μg/ml的药剂抑菌圈平均直径为12mm，而25μg/ml的药剂抑菌圈平均直径为10mm，同一药剂低浓度的抑杀实验结果反而比高浓度药剂的抑杀实验结果好，原因就是前者细菌菌台较薄。

3．空白对照的滤纸片表现出“假抑菌圈”

本实验中用灭菌水浸泡的滤纸片本不该出现抑菌圈，但有的培养基内的空白滤纸片仍出现“假抑菌圈”，原因是在贴滤纸片时滤纸片上有很多灭菌水，贴到菌台上后将周围菌台冲到外围，形成了“假抑菌圈”。因此，实验过程中不论是贴空白滤纸片还是贴药剂浸泡的滤纸片都应先将滤纸片上多余的液体揩净后再贴滤纸片，并且菌台表面也应是干的。

（二）实验讨论4．接种细菌时涂布的注意事项

涂布棒一定要提前灭好菌，先将同一菌种涂布完了，再涂布另一菌种。涂布另一菌种前先用酒精灯将涂布棒灭菌，待涂布棒冷却后再进行涂布，以免涂布棒温度较高将细菌烫死。涂布一定要均匀，且每次取菌前应将菌液摇匀，取相同量的菌液进行涂布，以确保不同培养基表面菌台厚薄相同。

5．注意各个环节无菌操作的规范

如应在酒精灯附近10—15cm处进行操作；手拿培养皿的姿势；滤纸片、无菌水、生理盐水及液体培养基的灭菌条件等。五、实验结论我们组通过分析实验结果，将试验中的抑菌剂效果进行排顺：对大肠杆菌而