基因工程概论和工具酶课件

基因工程学

GeneticEngineering医学院免疫学研究所张利宁

ZhangLining(张利宁）1978-1983M.DShandongMedicalCollege(Medicine)1983-1986Master’sdegreeShandongMedicalUniversity(Immunology)1986-1995Assistantprofessor，ShandongMedicalUniversity1996-1999

Associateprofessor,ShandongMedicalUniversity1999-2000VisitingScholar,UniversityofKentucky

2001-2005Professor,ShandongUniversity2001-2004Ph.DShandongUniversity(Immunology)2004.4–2005.4Visitingscholar,ColumbiaUniversity2005.5-present

Professor,Director,InstituteofImmunology,SDUE-mail:Immuno@Tel/p>

第一章基因工程的发展与应用

DevelopmentandApplications

ofGeneticEngineering

第一节基因工程发展的历史背景

一、基因工程发展的关键性理论1．20世纪40年代，Avery和Griffith报道了肺炎双球菌的转化研究，首次证明了生物的遗传物质是DNA。2．20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，从此为搞清生物遗传物质的分子机制奠定了基础。3．20世纪60年代Crick和Nirenberg等确定了遗传信息的传递方式，即DNA-RNA-蛋白质遗传信息流的中心法则，破译了氨基酸的64个遗传密码，编排了一本震惊世界的密码字典，由此揭开了生物遗传的谜底。

DNARNA蛋白质

一、基因工程发展的关键性理论1．20世纪40年代，Avery和Griffith报道了肺炎双球菌的转化研究，首次证明了生物的遗传物质是DNA。2．20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，从此为搞清生物遗传物质的分子机制奠定了基础。3．20世纪60年代Crick和Nirenberg等确定了遗传信息的传递方式，即DNA-RNA-蛋白质遗传信息流的中心法则，破译了氨基酸的64个遗传密码，编排了一本震惊世界的密码字典，由此揭开了生物遗传的谜底。

DNARNA蛋白质

二、基因工程的三大技术发明

1．限制性内切酶的分离与纯化1970年Smith和Wilcox首次从嗜血流感杆菌中分离纯化了限制性内切酶（restrictionendonuclease,RE）——HindIII限制性内切酶：具有识别特定碱基序列并在特定位置切除外来DNA的酶2．逆转录酶的发现1970年Baltimore和Temin同时各自发现了逆转录酶，打破了中心法则

mRNADNARNAProtein

1972年，美国斯坦福大学的P.Berg首次实现DNA重组phageSV401980年获诺贝尔化学奖

1973年Cohen和Boyer完成第一个基因工程实经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：限制性内切酶连接酶载体受体细胞第二节基因工程的发展与应用1982：第一个基因工程胰岛素商品化1985：PCR技术问世（Mullis）1990.10正式启动人类基因组计划1997克隆羊多利诞生（Weilmos）2000.6.26完成人类基因组工作草图绘制2003年4月完成人类基因组的测序，人类基因组计划宣布完成2003年后后基因组时代二、基因工程的应用1.基因工程在农业上的应用：除草、抗虫、耐旱、提高农作物的质量2.基因工程在畜牧业上的应用：提高动物的生长速度3.基因工程在工业上的应用：酶工业、微生物发酵工业、纺织业4.基因工程在生物医学上的应用临床治疗基础研究

在分子生物学研究的应用生长、发育与进化

（二）基因诊断基因诊断也叫DNA诊断、分子诊断从分子水平上对疾病进行诊断的方法。通过从患者体内提取样本用基因检测方法来判断患者是否有基因异常或携带病原微生物。1、方法：PCR、RFLP（限制酶片段长度多态性）、DNA探针、基因序列分析法等2、基因诊断的疾病

遗传性疾病：地中海贫血、血友病等110种

感染性疾病：乙型肝炎、爱滋病、衣原体等40种

恶性肿瘤：癌基因、抑癌基因的变异

其他疾病（三）基因治疗基因治疗（genetherapy)：将正常的外源性基因导入生物体或人体细胞内，以祢补缺失的基因或关闭或降低异常表达的基因，达到治疗疾病的目的。1、类型：性细胞基因治疗体细胞基因治疗

2、基因治疗发展的三个阶段

从20世纪80年代至今，基因治疗的发展经历了三个阶段：

（1）第一阶段：20世纪80年代初到80年代末禁锢期

（2）第二阶段：1990-1995狂热期，1990年之后，基因治疗进入临床试验，短短数年之内就有上百个临床方案，带来了医学生物学领域的一片狂热。

（3）第三阶段：1995-至今理智期1995年，美国NIH主持了对基因治疗临床试验的初步估计，使基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道。

3、基因治疗的应用目前已有150多家基因治疗公司，已有600多种临床方案正在研究。截至2002年，全世界已有636个方案进入临床试验，病例数达3496例。

（1）治疗遗传性基因疾病1990年，美国国立卫生研究所（NIH）首次对一名患有腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁女孩进行了基因治疗，由此标志着人类基因治疗正式开始。

审批：NIH下属的RAC（RecombiniantDNAadvisoryCommittee）

FDA（Foodanddrugadministration)联合审批

目前遗传病基因治疗的主要的研究对象

——————————————————————

疾病缺陷基因——————————————————————免疫学缺陷腺苷脱氨酶（ADA）血友病AVIII因子BIX因子高脂血症低密度脂蛋白受体高雪氏病葡萄糖脑苷脂酶地地中海贫血-珠蛋白基因镰状细胞贫血-珠蛋白基因笨丙酮尿症笨丙氨酸羟化酶肌肉萎缩症营养因子———————————————————————腺苷脱氨酶缺陷的基因治疗第一例：4岁的小女孩1990.7-8得到RAC和FDA的批准1991.9.14开始进行治疗前10个半月进行了7次恢复正常的T细胞占20-25%6个月后每3-5月进行1次，临床症状明显改进。T细胞的半衰期由30-35天增加到3-5月第二例：9岁的女孩

1991.1开始治疗获得成功

（２）恶性肿瘤：恶性肿瘤治疗方案居首位，为403个，病例数2,392例；神经、妇科、消化道、肺、皮肤、头颈部以及造血系统恶性肿瘤基因：

抑癌基因：用P53治疗非小细胞肺癌细胞因子：IL-2、TNF治疗黑色素细胞瘤等凋亡分子等（３）HIV感染（４）心血管疾病、代谢病

基因治疗必须解决三个关键问题：基因导入系统基因表达的可控性更多更好的治疗基因(四）基因工程药物1.基因重组药物自1982年世界上第一个基因重组药物“人胰岛素”在美国上市至今已有上百种产品问世，另有300多个品种处于临床试验阶段。全世界基因重组药物的使用以16%的速度增长。IL-2、IFN、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、EPO、TPO、生长激素、胰岛素等2.植物基因工程药物植物基因工程药物即利用转基因植物技术，在植物细胞中表达特定基因药物。在药物方面，将一些病毒或细菌的有用基因转入马铃薯等植物中，可大量、低成本地生产出疫苗，或通过直接食用该转基因植物而获得免疫力，如HBV转植物基因口服疫苗的研制。3.动物基因工程药物动物基因工程药物指利用转基因动物生产基因药物。用于分泌相应基因的蛋白质产物的动物器官（如乳腺）称为生物反应器。如用转基因绵羊生产蛋白质酶抑制剂ATT，其产率达到每升奶35克，可大量生产，用于治疗肺气肿，目前已进入Ⅲ期临床试验。4.基因组药物基因组药物是利用反向生物学原理，沿着从基因序列→蛋白质→功能→药物的途径研制新药。基因组和后基因组学提供了庞大的信息资源和结果，为新药的开发提供了优化条件，前景广阔。五、基因工程新方法与新技术开发与应用（一）单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）

SNP是人群中的一种单碱基差异，在人群或其他动物种群中的遗传变异中占有很高的比重。据估计在人类基因组上，平均每1kb就有一个SNP存在，SNP能充分反映个体间的遗传差异。意义：SNP与疾病敏感性SNP与对环境的反应性SNP与个体化治疗SNP与药物的敏感性

二）生物芯片技术：基因和蛋白质芯片技术

(micro-array)各种不同的cDNA点在一个芯片上从正常组织和病变组织中抽提总RNA用不同的颜色的荧光素标记RNA标记的RNA与芯片上的DNA杂交用计算机分析(三）转基因或基因敲除动物基本原理：基因同源重组MarioR.Capecchi，美国MartinJ.Evans，英国OliverSmithies，美国2007年诺贝尔医学奖获得者

他们的贡献因为他们在使用胚胎干细胞改造活体内特定基因的“基因靶向或基因打靶”技术等方面做出的突破性贡献。

Thisyear'sNobelLaureateshavemadeaseriesofground-breakingdiscoveriesconcerningembryonicstemcellsandDNArecombinationinmammals.

Theirdiscoveriesledtothecreationofanimmenselypowerfultechnologyreferredtoasgenetargetinginmice.Itisnowbeingappliedtovirtuallyallareasofbiomedicine–frombasicresearchtothedevelopmentofnewtherapiesGenetargetingisoftenusedtoinactivatesinglegenes.Suchgene"knockout"experimentshaveelucidatedtherolesofnumerousgenesinembryonicdevelopment,adultphysiology,aginganddisease.Todate,morethantenthousandmousegenes(approximatelyhalfofthegenesinthemammaliangenome)havebeenknockedout.Ongoinginternationaleffortswillmake"knockoutmice"forallgenesavailablewithinthenearfuture.

组织特异性基因敲除第三节人类基因组计划与后基因组时代

一、人类基因组计划二、模式生物的基因组计划

三、人类后基因组计划

四、后基因组时代新的分支学科

1．功能基因组学2．结构基因组学3.生物信息学4．比较基因组学5.蛋白质组学6.整体生物学7.药物基因组学第二章基因基本过程和研究策略基因工程的目的基因克隆(geneclonging)基因表达(geneexpression)-原核基因表达

-真核基因表达

-无细胞表达----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。

基因克隆(genecloning）

基因表达（geneexpression）

通过体外重组技术,将某一目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，使目的基因在受体细胞表达。即用基因工程方法获得有功能的异源蛋白质。基因克隆的技术路线

目的基因克隆载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA目的基因在细胞中表达的技术路线目的基因表达载体体外重组重组子（重组表达载体）转化受体细胞(原核细胞和真核细胞)筛选、鉴定阳性克隆大量扩增，表达外源蛋白基因工程的基本步骤一、获得目的DNA二、选择载体三、DNA重组四、将重组的DNA导入受体细胞五、阳性重组子的筛选、鉴定六、克隆基因的扩增或目的蛋白的表达基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因/使其表达③③基因工程的基本过程及研究策略1、目的基因的制备2、载体DNA选择及其改造3、体外DNA重组4、重组DNA的转化或转染5、重组体的筛选鉴定与克隆扩增6、目的DNA在受体细胞中的表达

一、目的基因的获得1、直接分离2、构建基因组文库3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示1、直接分离DNA—适用于克隆微生物的基因组基因组：某生物细胞内所含有的全套基因基因库：含有某生物细胞内全套基因的一组基因组文库克隆2、构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库(genelibrary)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）

3、构建cDNA文库，筛选目的基因

cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选

4、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行

PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法RT-PCR

5、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differentialdisplay,DD)—筛选差异表达的基因

二、载体的选择（一）克隆载体:（二）表达载体克隆载体克隆载体表达载体表达载体三、体外DNA重组基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。

四、重组DNA导入受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。转化（transformation）：在一定条件下，将质粒或以质粒为载体构建的重组DNA导入受体菌的过程。转染（transfection)：在一定条件下，将噬菌体、病毒或以噬菌体、病毒为载体构建的重组DNA导入受体菌的过程转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。2、对受体细胞的要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性感受态菌：是指细胞处于最适摄取和容忍外源DNA的状态重组体导入受体细胞的方法：1、氯化钙法2.电转化法3.脂质体转化法4.病毒介导五、重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）菌落原位杂交（InSituHybridizationofClone）2、鉴定：（1）PCR（2）酶切：长度和方向鉴定

（3)测序

六、目的基因的扩增或表达目的基因的克隆扩增目的基因在适当体系中的表达克隆扩增克隆：指含有相同DNA插入序列重组体的无性繁殖系。——以DNA重组技术，使特定基因或DNA在受体细胞内扩增的过程。氯霉素法扩增：将适量氯霉素加入培养基，使受体细胞染色体复制终止，而质粒复制继续，拷贝增加，提高质粒收获率

外源基因的表达基因表达包括：转录、翻译、加工、分离、纯化实现：DNARNA蛋白基因工程表达系统分原核、真核细胞和无细胞体系三类原核：大肠杆菌系统枯草杆菌系统真核：低等真核细胞系统（真菌）昆虫细胞系统哺乳动物细胞系统无细胞体系

无细胞体系偶联的转录/翻译系统的体外无细胞表达系统与基于细胞的蛋白表达系统相比较，无细胞蛋白表达系统具有节约时间、提高具有功能的、可溶的、全长蛋白的总体产量该系统包含兔网织红细胞裂解物或麦胚提取物，并带有T7、T3或SP6RNA聚合酶，这些系统使基于DNA的蛋白合成成为现实

TNT®兔网织红细胞裂解物转录/翻译偶联系统以质粒为模板，在一个试管内完成转录和翻译；TNT®PCRDNA快速系统对于PCR模板效果良好

表达产物的检测：

1、特异性鉴定：荧光抗体法免疫沉淀法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定

六、目的基因的扩增或表达第三章基因工程工具酶一、限制性内切酶二、T4DNA连接酶三、逆转录酶四、核酸酶S1五、末端脱氧核苷酸转移酶六、大肠杆菌DNA聚合酶

一、限制性内切酶限制性内切酶（Restrictionendonuclease,RE)能识别和切割特定ＤＮＡ序列的酶。是某些微生物具有的能切除和降解无关外来ＤＮＡ、抵抗外源性ＤＮＡ入侵的防御机制（一）限制性内切酶的命名原则属名的第一个字母（大写）种名的前两个字母（小写）变种或品系的第一个字母（大写）同一种微生物产生的几种酶，按发现顺序用罗马数字表示

EcoRI、EcoRV、（二）限制性内切酶的分类I型：无固定切点复合酶（内切酶、甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶四种活性）在DNA链上的识别序列与切割位点不同（一般在离识别位点1kb到几个kb的部位随机切割）DNA无固定切点，不产生特异性DNA片段II型：识别序列与酶切点在DNA链同一特定位置识别与切割DNA链上特异核苷酸序列产生特异性DNA片段分子量小，仅需Mg++作为催化反应的辅因子在基因工程中发挥重要作用III型：切点在识别序列之外复合酶（内切酶、甲基化酶）在DNA链上的识别序列与切割位点不同切点在识别序列的一侧一定距离的核苷酸位置

有特异的切点I、III型酶在基因工程中的价值不大（三）II型酶的识别与切割顺序1、识别特定的序列：一般4-6个2、识别序列具有180的旋转对称性(回文结构）3、对双连DNA（dsDNA）的两条连同时切割，可产生两种不同末端1）齐平末端2）粘末端：3’粘性末端5’粘性末端以某一对核苷酸为轴，其左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补，若按同方向阅读，其顺序相同。5`—GTATCCGGATAC—3`3`—CATAGGCCTATG—5`回文结构

平齐末端（flushend）

酶切点在识别序列的对称轴上如：SmaⅠ-ATCGAT--ATCGAT-

-TAGCTA--TAGCTA–粘末端（Cohesiveend）概念:双链DNA经Ⅱ型RE酶切后，双股DNA断端分别形成一小段互补的核苷酸单股序列称之粘性末端。粘末端特