DB37-T 4459-2021鹅星状病毒感染诊断技术规范

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 东 省 地 方 标 准DB37/T4459—2021鹅星状病毒感染诊断技术规范Diagnostictechnicalspecificationforgooseastrovirusinfection2021-12-272021-12-272022-01-27山东省市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。鹅星状病毒感染诊断技术规范范围本文件规定了鹅星状病毒感染的临床诊断和实验室诊断的技术规范。其中临床诊断包括流行病学、临床症状、病理变化；实验室诊断包括样品的采集与保存、病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光定量RT-PCR与间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。RT-PCRRT-PCRELISA（GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鹅星状病毒感染gooseastrovirusinfection由鹅星状病毒引起的5日龄～25日龄雏鹅内脏器官与关节发生严重尿酸盐沉积的疾病。4实验室要求环境4.1.1GB19489—2008GB/T27401RT-PCR（）4.2人员ELISA样品（PBS）A.15.2.2（100000IU/mL）。（100mg/mL）滤器0.22μm）NY/T541—2016//1mL1.5mLeppendorf372。eppendorfeppendorf1524h10g～20g（2000（2（50（1000IU/mL）pH7.0～7.410～20000r/min30min0.22μm泄殖腔（2000IU/mL）（2mg/mL）（50μg/mL）（1000IU/mL）pH7.0～7.4PBS10000r/min10min，410000r/min10mineppendorf-152wk；-7030在每次检测过程中，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。5～20日龄～1520%～3050患病雏鹅表现为精神沉郁、卧地倦动、采食减少、排白色稀便。同时符合6.1、6.2、6.3，则判断为疑似鹅星状病毒感染。同时符合6.1、6.2、6.3，则判断为疑似鹅星状病毒感染。7病毒分离鉴定7.1.1.1（2～82070）3741mL13130.2/，376d24h，24h～144h4201h，3d～5RT-PCRPCR（15000r/min）。RNA（1.5mL）PCR（0.2mL）（10μL、20μL、100μL、1000μL）。RNA0.01。DEPCRNARTPCR1.0A.2。1×TAEA.3A.4DNA100bp～2000bp5阳性对照标准品，使用鹅星状病毒SDPY（CCTCCNO:V201808C）RT-PCR——上游引物F：5’-TGGTGGTGYTTYCTCAARA-3’；60110μmol/LRNA按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的RNA。提取的RNA应立即检测，否则应置于-70℃冻存。RT-PCR7.2.1.3.2.1RNaseInhibitor0.5μL，M-MLVbuffer2μL，RandomPrimers1.0μL，dNTPs（2.5mmol/L）1μRase-ML0.5μRN5L10L3010m4260mi，7015min，4PCRPCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2F（10和R（10μmol/L）各0.5cDNA3DNA0.25μL，加DEPC25μLPCR530s，7230s，30；7210min1.01100mL1×TAE5μL核酸染料溶液，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm（）1×TAE6μL～8μLPCR2μLMarker80V～100V40mA～5030min～40min试验成立的条件试验成立的条件阳性对照出现601bp试验结果的判定601bpPCRPCRB.1）RT-PCR仪器设备生物安全柜。（15000r/min）。RNA（1.5mL）RNAPCR微量移液器（10μL、20μL、100μL、1000μL）。RNAPCR试剂与材料DEPCRNART-PCRSDPYRT-PCRF：5GGTGGGCTAATAACGGAACTCAG-3’；R：5’-GACCTATTTCCTTGCGGATCAC8910μmol/LRNARNA提取参照7.2.1.3.1。RT-PCRPCR2×OneStepRT-PCRBuffer10μL，TakaraExTaqHS0.4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4μL，引物F（10μmol/L）和引物R（10μmol/L）各6020s（），40阳性对照出现S型扩增曲线，且阴性对照无扩增曲线时，判定检测结果有效。Ct≤30SCtCt3530＜Ct＜35B.2）8病毒抗体检测（间接ELISA）（6020s（），40阳性对照出现S型扩增曲线，且阴性对照无扩增曲线时，判定检测结果有效。Ct≤30SCtCt3530＜Ct＜35B.2）8病毒抗体检测（间接ELISA）（15000rpm）10μL、20μL、100μL、1000μL378.2试剂与材料D.1D.2D.3。IgG1:32A.5A.6（）A.7TMB（2M）A.8将OR26.5mg/L用1（H9.稀释2000100μL96，4540200μL，371h8.3.1A1、A2100μLA3、A4100μL100μL，371h8.3.11:20010μ371h83.1100μLTMB3715min50μL450nm（OD）鹅星状病毒间接ELISAOD均值=（ODA1+ODA2）/2；阳性对照OD均值=（ODA3+ODA4）OD450≥0.21OD450≤0.178.4.2.30.17＜OD450＜0.21根据第6章、第7章、第8章中的判定结果，可对鹅星状病毒感染进行综合判定。67867878附录A（资料性）相关试剂的配制（试剂要求分析纯）（PBS，0.01mol/LpH7.4）NaCl 8.0KCl 0.2KH2PO4 0.2Na2HPO4.12H2O 0.2水加至1000mL1.0琼脂糖 1.00.5×TAE电泳缓冲液加至100mL50～601×TAE配制0.5mol/L（EDTA-Na2）（pH8.0）灭菌蒸水 80.0mL氢氧钠pH至 8.0100灭菌蒸水 80.0mL氢氧钠pH至 8.0100A.3.2中的50×TAEA.3.2配制50×TAE电泳缓冲液羟基基基烷（Tris）242冰醋酸 57.1mL0.5mol/L二四酸（EDTA-Na2）液（pH100mL灭菌纯加1000mL用于制A.3.3中的1×TAE电泳冲A.3.3配制1×TAE电泳缓冲液50×TAE电泳缓冲液20mL水加至1000mL（10×）聚蔗25灭菌蒸100溴酚蓝 0.1二甲青 0.1（0.05mol/LpH9.6）Na2CO3 0.2756NaHCO3 0.6216水加至100mL洗涤液PBS1000mLTween-20 0.5（）脱脂粉 5.0洗涤液100mL（2M）H2SO4（9858mL水442附录B（资料性）PCR及荧光定量PCR结果图PCRM为分子量标准；1为阴性对照，2为阳性对照。图B.1PCR产物大小对照图PCR1为阳性对照，2为阴性对照。图B.2PCR附录C（资料性）阳性对照病毒（SDPY）SDPY50SDPY（CCTCC），CCTCCNO:V20180813105.0ELD50SDPY该病毒株涉及以下专利：20181附录D（资料性）ELISA抗原和血清标准用鹅星状病毒SDPY株感染3周龄～4周龄健康雏鹅，感