食品分子生物技术课件

中央领导高度重视2004年8月以来胡锦涛总书记先后多次在关于发展生物技术的相关报告上批示或圈阅：民盟中央科技部发改委农业部林业局2004年8月11日，温家宝总理批示：

发展生物技术，实现产业化，不仅关系国家的可持续发展，而且关系人民的生活和健康，应该作为国家经济、社会发展和科技进步的重点，列入中长期规划，并认真组织实施。我国有发展生物技术的基础，在这方面可以搞得更好更快一些。2004年6月24日，国务委员陈至立主持召开会议，听取李部长代表科技部关于生物技术研究开发和促进产业化的汇报。会议同意科技部提出的五点建议：

1.成立国家生物技术研究开发与促进产业化领导小组;2.抓紧制定“中国生物技术及产业化发展纲要”;3.继续组织实施“转基因植物研究与产业化专项”;4.做好制定《中华人民共和国生物安全法》的前期工作;5.成立“中国生物技术行业协会”。我国在大科学工程中的国际地位迅速提升人类基因组：1％水稻、家蚕、血吸虫：100％

1998年之前在《NATURE》和《SCIENCE》发表文章为空白1998年夏家辉在《NATUREGENETICS》发表论文“十五”以来在上述杂志发表论文14篇1980年以来在《CELL》上连续25年未发表论文2005年一年内在《CELL》发表了5篇论文我国生命科学和生物技术论文水平迅速提升创新能力显著提高2010年,我国科学家发表的国际科学论文总量增加到12.8万篇,跃居世界第二位。被引用数由2005年世界第13位升至2009年的第8位产业发展势头强劲7300多家，其中核心企业2800多家产值：现代生物技术产业：600亿元传统生物技术产业：3000亿元产品：全球销售额前10位的生物药中国能生产8种转基因植物种植面积：世界第三世界上第一个上市基因治疗药物：P53SARS疫苗：世界上第一个完成了一期临床试验疫苗、青霉素、维生素C、氨基酸等产品产量和消费量全世界第一企业：（2003）一是把发展能源、水资源和环境保护技术放在优先位置，下决心解决制约经济社会发展的重大瓶颈问题。二是抓住未来若干年内信息技术更新换代和新材料技术迅猛发展的难得机遇，把获取装备制造业和信息产业核心技术的自主知识产权，作为提高我国产业竞争力的突破口。三是把生物技术作为未来高技术产业迎头赶上的重点，加强生物技术在农业、工业、人口与健康等领域的应用。四是加快发展航天和海洋技术。五是加强基础科学和前沿技术研究，特别是交叉学科的研究。

生物技术被列为五个科技战略重点之一国家中长期科学和技术发展规划前沿技术——生物技术

靶标发现技术；动植物品种与药物分子设计技术；基因操作和蛋白质工程技术；基于干细胞的人体组织工程技术；新一代工业生物技术；

转基因生物新品种培育。重点研究功能基因克隆与验证、规模化转基因操作、生物安全评价三大核心技术，建立和完善优异种质创新、新品种培育和规模化制种三大技术平台，获得功能验证的新基因1000个以上；建立我国转基因生物育种体系，培育转基因农作物新品种（系）100~150个，转基因动物新品种（材料）30个以上。

重大新药创制。重点研究化学药和生物药新靶标识别和确证、新药设计，以及药物大规模高效筛选、药效与安全性评价、制备和成药性预测关键技术，开发疗效可靠、质量稳定的中药新药，研制30~40个具有知识产权和市场竞争力的新药，完善新药创制与中药现代化技术平台，初步形成支撑我国药业发展的新药创制技术体系。

艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治。重点突破新型疫苗与治疗药物创制等关键技术，自主研制40种高效特异性诊断试剂、15种疫苗及药物，研究制定科学规范的中、西医及其结合的防治方案，建立10个与发达国家水平相当的防治技术平台，初步构建有效防控艾滋病、肝炎的技术体系。“十一五”科技计划体系中生物技术重大技术专项四川泡菜产业发展迅速，2008年全省泡菜加工量达100万吨，位居全国第一，泡菜加工产值达到75亿元。年产值1000万元以上的泡菜加工企业有119家，上亿元的有12家。市场份额占全国的50%以上，产品远销日本、韩国、美国、澳洲、欧盟、东南亚等近20多个国家和地区。泡菜Rockfeller

大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）；Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）；Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）。基因“十一五”期间，

转基因生物新品种培育取得的最重要成果，就是新型转基因抗虫棉。2008年至2010年，新培育36个抗虫棉品种，累计推广1.67亿亩，实现效益160亿元，国产抗虫棉市场份额达到93%，彻底打破了国外抗虫棉的垄断地位。

转基因生物新品种培育取得的成果“十一五”期间，人乳铁蛋白转基因奶牛技术已获准进入转基因生物安全生产性试验，这是中国首批进入生产性试验的转基因动物，有望两年后获得安全证书，率先实现转基因动物产业化。

“十一五”期间，控制水稻理想株型的关键多效基因ＩＰＡ１成功克隆。理想株型是当前国内外超级稻研究中的一个核心领域。实验显示，将突变后的基因导入常规水稻品种，可以使其产量增加１０％左右。生物技术和产业化是“十二五”科技规划布局的重点，突出加强生物技术在农业、工业、人口与健康领域的应用。

食品工业中的食品生物技术速览1.食品原料的生产：转基因辣椒及抗病虫害玉米2.食品添加剂的生产

3.发酵食品---酸奶、果酒“十二五”科技规划二、食品生物技术的研究内容（一）基因工程（二）酶工程（三）发酵工程（四）细胞工程（五）蛋白质工程（六）生物工程下游技术（七）后基因组学（八）现代分子检测技术（一）基因工程定义：在体外将异源DNA（目的基因）与基因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。作用：实现遗传信息的跨物种转移。GMO1.食品资源的改造目的：一方面提高了农作物产量和改善农作物的抗虫、抗病、抗除草剂和抗寒等能力，另一方面使食品的营养价值、风味品质得到改善，食品储藏和保存时间有所延长。

基因工程的用途改造生物，创造对人类有用的新品系、新物种。1973年，美国斯坦福大学的斯坦利·科恩教授首次开发成功转基因技术。10年后，第一株转基因植物诞生。

1983年，世界上成功培育了第一例转基因植物：烟草。

1993年，美国市场上投放了第一例转基因食品：晚熟西红柿。

1994年美国农业部(USDA)和美国食品与药品管理局(FDA)批准第1个转基因作物产品延熟保鲜转基因番茄获得进入市场。

1996年、1997年，第一例转基因耐贮存番茄获准并商品化生产。

自1995年起，全世界转基因食品开始商品化并发展。

转基因食品遍及六大洲—北美洲、拉丁美洲、亚洲、大洋洲、欧洲和非洲，转基因食品大多数集中于发达国家（占总数的85％），主要是美国、加拿大，发展中国家只占24％左右。

四大主要种植国主要为美国、阿根廷、加拿大，中国。基因工程的用途改造的食品原料特征：1.1抗病、抗虫、抗除草剂和抗旱性等作物

据统计，1983年以来,美国有48种不同植物的3000多例转基因植物问世，包括番茄、大豆、小麦、水稻、玉米、马铃薯、西葫芦等，其中涉及品质改良的占21.4％,近30种转基因植物已经被准许进行商业性种植。其中仅两种抗病番木瓜，就挽救了美国夏威夷番木瓜产业。抗虫和推迟成熟的西红柿，可减少化学农药的使用和对其依赖性，减少环境污染、运输损失。基因工程的用途基因工程的用途至2010年底我国已批准商业化生产有多项，转基因农作物已批准19种,作为食品加工原料的有12种，分别是：大豆（7例）、玉米（30例）、棉花（28例）、油菜（12例）、番茄（9例）、西葫芦（2个）、甜瓜（1个）、番木瓜（2个）、甜菜（2个）、亚麻（1个）、马铃薯（3个）、甜椒（1个）。包括：北京大学培育的转基因抗黄瓜花叶病毒甜椒、抗黄瓜花叶病毒番茄，目前累计种植3000多亩；我国第一个商品化生产的转基因耐储藏番茄，在室温下储藏56天，好果率达70％以上。基因工程的用途有专家替我们算了一笔帐：转基因水稻可以使农民少用80%农药，增产6%～8%，农民每公顷平均增收676元，如果全国90%地区种植转基因水稻，粮价将必然下降，社会福利每年增加41亿美元。更直接一点的说法就是：转基因水稻晚推广一年，我们就等于放弃了每年200亿的收入。基因工程的用途1.3具有特殊品质的基因工程生物

如基因工程技术已培养出含水量大大降低的西红柿、洋葱、马铃薯新品种，其特点是可节约单耗、加工能耗、延长货架期；培养出了带咸味和奶味的适宜膨化加工的玉米新品种，以适应低盐、低脂肪的消费需要；获得了出油率高、不饱和脂肪酸含量较高的油料作物等。基因工程的用途2.食品加工过程和食品品质的改良2.1改良食品微生物的生产性能

由于微生物的遗传变异性及生理代谢的可塑性是其他生物难以比拟的，因此微生物资源的开发具有很大潜力。目前的工作包括采用常规的诱变、杂交方法与细胞融合、基因工程技术结合进行菌种改造，和采用基因工程和蛋白质工程技术构建“基因工程菌”。基因工程的用途这些研究工作的意义包括：(1)

提高发酵食品质量并使加工过程更合理化。

啤酒是我国传统的发酵工业产品之一，2010年全国啤酒产量为4483.04万千升（连续8年稳居世界第一），全年工业总产值1320.65亿元，1-11月，啤酒行业实现主营业务收入1223.8亿元。生物技术已用于啤酒酵母的改造，如将α－乙酰乳酸脱羧酶基因克隆到啤酒酵母中进行表达，可降低啤酒双乙酰含量而改善啤酒风味；选育出分解β－葡聚糖和糊精的啤酒酵母，能够明显提高麦汁的分解率并改善啤酒质量；构建具有优良嗜杀其他菌类活性的嗜杀啤酒酵母已成为实现纯种发酵的重要措施。(2)实现重要产品的高水平、低成本生产。

氨基酸是我国新型的发酵工业产品之一，目前，国外已有5种氨基酸用重组菌实现了工业化生产，达到较高水平（如苏氨酸60g／L、组氨酸42g／L、脯氨酸75g／L、丝氨酸40g／L和苯丙氨酸60g／L）。生物技术专家还将霉菌的淀粉酶基因转入酵母中使其能直接利用淀粉生产酒精，省掉了高温蒸煮工序，可节约60％的能源，生产周期大为缩短。这对我国年产量约350～400万吨，产值达150～200亿元的酒精工业将产生重大影响。基因工程的用途2.2应用于食品酶制剂的生产利用基因工程技术不但可以成倍地提高酶的活力，而且还可以将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因工程菌来生产酶。据1995年统计，已有50％的工业用酶是用转基因微生物生产的。

转基因微生物生产酶有许多优点，如产量高、品质均一、稳定性好、价格低等。第一个应用于食品上的基因工程酶为凝乳酶（Chymosin），它是制造干酪过程中起凝乳作用的关键酶，传统来源是从小牛皱胃液中提取。基因工程的用途基因工程的用途近20年来用基因工程菌发酵生产的食品酶制剂主要有：凝乳酶、α－淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、转化酶、普鲁多糖酶（茁霉多糖酶）、脂肪酶、α－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、α－乙酰乳酸脱羧酶、溶菌酶、碱性蛋白酶等。日本应用转基因微生物制造琥珀酸。琥珀酸是工业上一种重要的高分子化合物，能够用来制造可降解塑料和电子产品用纤维，目前市场需求量不断增加。但通常的生产方法效率低下，成本高，每千克产品售价高达数十美元。而新技术可把生产成本降低到每千克1美元以下。3.植物食品基因工程进展目前食品基因工程的研究主要集中在食品的蛋白质、碳水化合物工程、油脂工程、贮藏保鲜工程等方面。3.1蛋白质工程合成基因的导入和表达。同源基因的导入和表达。异源基因的导入和表达。基因代谢调控技术：在基因代谢调控技术情况下，导入的基因不是用来直接合成所需的蛋白质，而是用来合成控制代谢途径中的关键酶，从而改变某一代谢的途径、方向和强度，从而增加代谢产物的量或获得新的代谢产物。基因工程的用途3.2碳水化合物工程

食品的碳水化合物工程只能采用基因代谢调控技术，而不能采用基因添加技术，即只能通过改变碳水化合物代谢途径中的关键酶，达到提高碳水化合物含量或调整其组成的目的。基因工程的用途高等植物体内涉及淀粉生物合成的酶类主要有ADP葡萄糖焦磷酸酶（ADP-GPP）、淀粉合成酶（SS）和分枝酶（BE）。ADP-GPP酶催化ADP-葡萄糖的合成，SS酶催化ADP-葡萄糖添加到葡萄糖链上，BE酶将分支引入1，4-葡聚糖链上。这三个酶的基因都已从多种植物中克隆，可应用于碳水化合物工程中。

改变淀粉或糖的含量。改变淀粉的组成。基因工程的用途3.3油脂工程

高等植物体内脂肪酸的合成由脂肪合成酶（FAS）的多酶体系来控制，因而改变FAS的组成就可以改变脂肪酸的链长和饱和度。目前，控制脂肪酸链长的几个酶的基因和控制去饱和作用的一些酶的基因都已克隆成功。

控制脂肪酸的链长。控制脂肪酸的饱和度。基因工程的用途英国科学家近日利用转基因技术使新培育出的水芹富含鸡和鱼所含的多不饱和脂肪酸，让水芹不再只是主妇们菜篮中一种普通蔬菜，而成为一种“超级保健”蔬菜。英国布里斯托尔大学的科学家从海藻和蘑菇中分离出负责制造多不饱和脂肪酸的3个基因，并植入水芹。伦敦圣·乔治医院营养学家凯瑟琳·科林斯说，这种基因水芹可以直接食用，也可以通过饲喂动物进入食物链后再供人食用，这一成果是功能性食品研究的又一大进展。基因工程的用途3.4延迟果实成熟延迟果实成熟是食品基因工程研究的热点问题。乙烯是果实成熟的关键物质。乙烯的生成途径为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）在氨基环丙烷羧酸合成酶的催化下生成氨基环丙烷羧酸（ACC），后者再在ACC氧化酶催化下生成乙烯。3.5药理作用的食品

采用生物遗传工程技术，提取细胞内含有某种病菌抗原的作物种子，然后就可以像其他作物一样种植和收获，人们只要正常食用就可以起到预防某种疾病的作用，这就是疫苗食品。

美国的研究人员已成功地培育出携带白喉抗原的萝卜及预防其他一些疾病的马铃薯、甘蓝、西红柿等，人们食用后免疫效果都非常理想。基因工程的用途美国康奈尔大学培育成功一种香蕉，人们食用后，就可避免乙肝、霍乱和细菌性痢疾等传染病的侵袭；英国生物遗传学家应用植物细胞嫁接抗原基因的技术，已培育出一种可以预防霍乱的苜蓿苗。中国研究人员通过花粉管道使外源疫苗导入植物细胞的方法，在多种农作物上进行疫苗食品的试验。一种抗乙肝基因西红柿培育成功，食用几个含有抗乙肝基因的西红柿，就能代替注射乙肝疫苗。3.6其他植物转基因食品（二）酶工程定义:把酶或细胞直接或经过一定的修饰后应用于化学反应的生物催化工程。研究内容:新酶的开发和生产、酶分子的修饰、酶的分离纯化技术、酶的固定化技术、酶反应器、酶生物传感器等。在食品、医药、化工、环保等多领域的革新产生重大作用。包括固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系。生物技术对食品工业生产影响最大的还是酶工程和发酵工程。

2001年世界酶制剂年销售额达16亿美元，2008年销售额达到30亿美元。我国各种工业酶制剂总产量超过3.2×105t，产值6亿美元。如应用于酒精、味精、有机酸、啤酒、淀粉糖、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等许多工业领域，创造工业附加值数千亿元。

酶工程在食品工业中的应用但世界上酶制剂的研发、生产和应用大部分集中于发达国家，位居世界前列的是丹麦的Novozymes

和美国的Genencor公司，其酶制剂的销售额约占世界总额的70%，中国在世界范围内的份额不足5%。Novozymes

和Genencor公司每年用于技术开发的资金占其销售额的比例达到12%～13％。仅在中国Novozymes

就投资了1.7亿。酶工程在食品工业中的应用酶工程在食品工业中的应用我国酶制剂的主要应用领域是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的60%，我国更高达85%以上。酶制剂对我国食品工业的技术进步作出过突出贡献：在啤酒生产中，采用淀粉酶的新型辅料液化工艺以及复合酶制剂的应用对提高我国啤酒的产量和质量有重要意义；在白酒和酒精生产中，利用糖化酶替代酒曲实现了我国酿酒工艺的重大变革。

酶工程在食品工业中的应用在玉米深加工领域，采用耐高温淀粉酶和糖化酶的“淀粉喷射液化”技术以及“双酶法”糖化技术全面带动了我国淀粉糖、味精、柠檬酸等生产工艺的改革；近年来，蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等在果酒、果汁、调味品、烘焙、肉制品、中药有效成分提取以及多肽保健品生产中的应用也都取得较大进展。

酶工程在食品工业中的应用酶在食品原料加工中的应用（1）淀粉类食品加工中如生产麦芽糖、葡萄糖、饴糖、低聚糖、高果糖浆等用的淀粉酶。（2）利用凝乳酶生产奶酪，目前已通过酵母发酵获得凝乳酶。（3）果胶酶在果汁生产中的应用大大提高了出汁率。酶制剂用于改善食品质量蛋白酶嫩化肉、果胶酶澄清果汁等。酶在食品保鲜和贮藏中的作用（1）葡萄糖氧化酶的保鲜作用。（2）溶菌酶的保鲜作用。（三）发酵工程生物技术主要通过发酵工程实现产业化。定义：即微生物工程。采用现代发酵设备，使经微生物育种和基因重组技术改良的细胞或经其他现代技术改造的菌株进行放大培养和控制发酵，获得工业化生产预定的食品产品或食品的功能成分。1.微生物菌体发酵2.微生物酶发酵3.微生物代谢产物发酵4.微生物的转化发酵5.生物过程细胞的发酵发酵类型发酵工程的应用领域1.医药工业方面2.食品工业方面3.能源工业方面4.饲料工业方面5.冶金工业方面6.农业方面发酵工程产品种类抗菌素免疫调节剂类固醇核苷酸酶制剂抗病毒剂心血管药物杀虫剂氨基酸有机溶剂抗肿瘤制剂神经系统药物除草剂有机酸食品与饮料抗氧化剂维生素多肽色素气体化合物可降解塑料人类利用微生物的发酵作用制造食品的历史悠久，产品种类繁多:

（1）各类调味品：如酱油、醋、味精、豆腐乳等。（2）酒类产品：如白酒、啤酒、葡萄酒等。（3）各类焙烤食品：如面包等。（4）各种发酵饮料：如酸奶等。（5）发酵香肠、酸泡菜等。

经发酵作用后，食品的色、香、味发生变化，更富有营养。

发酵工程在食品工业中的应用酒精测试结果189毫克/100毫升。

发酵工程在食品工业中的应用改良面包酵母菌种的应用：将有较高活力的酶基因转移至面包酵母，使面包酵母显著地提高麦芽糖透性酶及麦芽糖酶的活力。凝乳酶的生产：将小牛胃中的凝乳酶基因转移至大肠杆菌或酵母中。现代生物技术在食品工业中的应用：（四）细胞工程定义指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁殖动植物个体，或获得某种有用物质的技术。它包括细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物大量控制性培养技术，还包括染色体工程和细胞质工程等内容。细胞工程分类按生物种类分：动物细胞工程：以动物细胞为生产对象；植物细胞工程：以植物细胞为生产对象；微生物细胞工程（发酵工程）。动物细胞工程产品以药物为主：集落刺激因子红细胞生成素抗血友病因子组织纤溶酶原激活物为什么要用卵细胞的细胞膜而不用其细胞核？1.由于卵细胞体积大，便于操作；2.由于卵细胞的细胞质可以使已分化的细胞核脱分化。利用植物细胞工程生产的部分商品生物碱紫杉醇植物多糖麻醉剂强心苷各种激素有机酸苯酚各种维生素抗过敏剂青蒿素风味素单宁生物碱苯基苯乙烯酮天然杀虫剂各种蛋白及多肽植物生长调节剂抗血友病因子抗病毒剂甜味素黄酮类各种蛋白酶各种植物油脂香水甾醇类及其衍生物抗肿瘤因子芳香剂橡胶乳液苯醌酶抑制剂核酸及核苷酸抗过敏剂色素萜类及其衍生物（五）蛋白质工程--第二代基因工程定义：从蛋白质分子结构的设计入手，将待改进的蛋白质提纯为结晶，用X-射线等手段研究其空间构象，确定其需要改变的氨基酸残基，然后再用基因定位突变和体外定向进化等方法达到修饰蛋白质空间结构的目的。蛋白质工程取得的成果将T4溶菌酶的3位异亮氨酸换成半胱氨酸，再跟97位半胱氨酸连接起来。这样，T4溶菌酶在67℃下反应

3h后，活性丝毫未减。在-70℃低温下难以保存的干扰素，经蛋白质工程的点化，两个半胱氨酸被换成丝氨酸，一下子变得可以保存半年之久。一种生产中很有用的酪氨酸转移核糖核酸酶，只是在一个位点上用脯氨酸取代了苏氨酸，催化能力一下子提高了25倍。对于用小鼠细胞培养生产的单克隆抗体，专家们已经提出了“开刀方案”，打算把它整修得更接近于人的抗体，以减轻副作用。（六）生物工程下游技术生物工程下游技术：指将发酵工程、酶工程、蛋白质工程和细胞工程生产的生物原料，经过提取、分离、纯化、加工等步骤，最终形成产品的技术。（七）后基因组学2003年，人类基因组图谱草图绘制成功。“基因组学”和“蛋白质组学”形成的基础：“一个基因可以编码数个蛋白质”。阐明生活细胞的基因编码及其调节控制和阐明蛋白质之间的交互作用。“营养基因组”研究的启动：通过对基因表达蛋白质和其他代谢物等进行全面的分析。研究食品以及食品原料对人体产生影响，为进一步探索食品功能、作用机理和食品资源开发提供科学依据。（八）现代分子检测技术核酸分子检测技术蛋白质分子检测技术生物芯片技术生物传感器三、食品生物技术的特点1、与食品产业化紧密相关。

目标是产品。对改造传统食品工业和农副产品深加工具有革命性意义和较大的经济价值。S基因技术PM企业上游过程下游过程控制系统发酵或酶技术酶解技术分离技术检测技术市场营销食品生物技术产业链示意图三、食品生物技术的特点2、属边缘交叉学科。3、具有“六高”基本特征。

高效益、高智力、高投入、高竞争、高风险

和高潜力。4、属高新技术范畴。5、已经成为食品科学发展的重要研究方向。四、食品生物技术发展简史1、史前时期传统食品产品的形成。2、近代时期菌种选育、诱变技术的发展和纯种发酵。3、现代的发展生命的本质----遗传物质DNA结构的发现。五、分子生物学的形成与发展1、细胞学说。17世纪末，AntonVanLeeuwen

hoek观察到活细胞。1831年，RobertBrown发现细胞核。19世纪中，Schleiden﹠Schwann创立细胞学说。2、生物进化论。3、孟德尔遗传定律。4、基因学说。1909年ThomasHuntMorgan发现突变现象。1911年WJohanssen把遗传因子命名为“gene”。1926年Morgan创立基因学说。5、基因本质的发现。1928年，Griffith用一个著名的实验证明遗传物质不是蛋白质。6、分子生物学的诞生。1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构。1965年，基因与酶学说。1969年，DNA密码，基因转导。1972年，限制性内切酶。1977年，DNA的合成。1986年，PCR技术。五、分子生物学的形成与发展六、现代生物技术的意义与展望1、发展食品生物技术的意义开发新资源食品、解决食品短缺；开发新型功能食品、生产环保食品、丰富食品种类；食品生物技术已经渗透到食品工业的方方面面；21世纪的食品工业将是建立在现代食品生物技术和现代食品工程技术两大支柱上的一个全新的朝阳产业。2、现代生物技术展望基因重组技术的进一步完善；基因工程药物和疫苗的研究与开发的猛进突飞；转基因动植物取得重大突破；生命基因组计划在许多生命领域展开；基因治疗的重大进展；蛋白质工程、酶工程、发酵工程在基因工程基础上的长足的发展；信息技术渗透到生物技术的领域中。六、现代生物技术的意义与展望定义：

用酶学的方法，在体外将异源DNA（目的基因）与基因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并将其导入宿主细胞，使异源基因在宿主细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要的生物品种和产物。第一节基因工程概述作用：

实现遗传信息的跨物种转移。特点：

⑴属分子水平上DNA转移过程和细胞水平上的表达；⑵基因的切割、连接等操作全靠酶学方法；⑶基因工程整个过程体现不同种间进行无性繁殖，即为克隆过程；⑷在体外建立无性繁殖体系，易于产业化和规模化，对人类健康和经济建设的发展产生巨大作用。

第一节基因工程概述基因工程的发展史：

1、理论上的三大发现证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）。DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。遗传信息的传递方式（中心法则）。第一节基因工程概述2、技术上的三大发现限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA

重组时代的开始）。载体的使用。1970年，逆转录酶的发现。第一节基因工程概述3、基因工程的诞生1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生。KanamycinR6-5TetracyclinepSC101EcoRIDNALigaseKanrandTetr第一节基因工程概述为什么用病毒的或原核生物基因组开始？基因组总长度短，编码基因少，可避免过多DNA序列的干扰。能够在感染宿主细胞中扩增至更多拷贝，同时也便于与宿主细胞分离。第一节基因工程概述1977年英国分子生物学家F.Sanger发明了快速DNA测序技术，并首先完成了全长5387bp的φ×174噬菌体基因组全序列的测定，揭开了大规模基因组测序工作的序幕。1982年第一个由基因工程菌生产的药物胰岛素在美国和英国获准使用。1983年第一个转基因植物培育成功。1990年患有遗传免疫疾病的4岁女孩接受了基因疗法。1992年第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生。1994年转基因番茄上市。1996年完成了酵母基因组DNA（125×105bp）的全序列测定。第一节基因工程概述1991年，美国开始人类基因组计划。有美、英、日、德、中六国参与的国际人类基因组计划是人类文明史上最伟大的科学创举之一。其核心内容是测定人基因组的全部DNA序列，从而获得人类全面认识自我最重要的生物学信息。于1999年9月1日中国正式加入该计划，承担了1%人类基因组（约三千万个碱基）的测序任务。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等六国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。已完成的序列图覆盖人类基因组所含基因区域的99%，精确率达到99.99%，这一进度比原计划提前两年多。第一节基因工程概述第二节基因工程的分子生物学基础一、遗传信息传递的方向——中心法则DNA双螺旋结构模型的提出和半保留复制机理（Watson&Crick,1953)遗传信息传递的中心法则（Crick,1958）1958年Crick提出遗传信息传递的中心法则：

DNA通过以自身为模板进行复制而使遗传信息代代相传，并通过RNA最终将遗传信息传递给蛋白质分子。③DNARNA蛋白质①

②

④遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则第二节基因工程的分子生物学基础Crick于1971年对中心法则作了补充，提出三角形中心法则。

遗传信息传递的中心法则注：虚线部分是未证实的设想途径DNARNA蛋白质翻译翻译转录逆转录复制复制？第二节基因工程的分子生物学基础二、DNA的复制

对遗传物质的关键性要求：它必须能够准确地复制。ATTTATPuTTTATAAATAPyAAAT酵母自主复制序列（GenesIVP336，1990,B.Lewin）DNA复制特点如下：自主复制DNA复制从特定的位点开始，这个特定位点就称做复制起始点。第二节基因工程的分子生物学基础半保留复制：DNA复制具有高度的忠实性：其复制的忠实性与DNA聚合酶所具有的自我校正功能密不可分。DNA聚合酶自我校正功能：DNA聚合酶本身所具有的3´-5´的外切核酸酶活性，使其能对错配的碱基进行有效的校正，从而保证了DNA复制的高度忠实性。即双链DNA分子在复制过程中，DNA的两条链各自作为新链合成时的模板。复制后，每一双链体都是由一条亲链和一条新合成的子链组成。第二节基因工程的分子生物学基础三、DNA聚合酶DNA聚合酶是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶，其催化的反应为：DNA聚合酶dATP、dTTP、dGTP、dCTP，Mg2+

DNAOHDNA-（pdN）n+nPPi

第二节基因工程的分子生物学基础第二节基因工程的分子生物学基础真核细胞DNA复制模型真核细胞DNA复制模型真核细胞DNA复制模型起始解旋酶DNA聚合酶DNA聚合酶解旋酶真核细胞DNA复制模型第二节基因工程的分子生物学基础四、RNA的转录和RNA的加工（一）RNA的转录转录：指在DNA模板上合成RNA的过程。转录是基因表达的关键一步:DNA分子中贮存的遗传信息，必须转录成信使RNA（mRNA）才能通过蛋白质生物合成的过程转变成具有生物活性的蛋白质。

第二节基因工程的分子生物学基础1、RNA合成的基本特征:（1）RNA聚合酶是RNA合成的关键酶。（2）RNA合成是以四种核糖核苷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）为底物。（3）RNA转录是以一条DNA为模板，按照碱基互补的原则（A=U，G≡C）进行转录。第二节基因工程的分子生物学基础（4）RNA的合成过程包括：①RNA聚合酶结合于DNA分子上的特定位点；②使DNA双链解旋，起始RNA合成；③RNA链的延伸；④RNA合成的终止和释放。其整个的反应过程可以下式表示：

nNTP+XTP(NMP)n-XTP-nPPiRNA聚合酶DNA模板，Mg2+其中：NTP代表四种核糖核苷三磷酸；XTP代表RNA5′末端的核苷三磷酸；PPi代表合成过程中释放出的焦磷酸。在37℃，RNA聚合酶的合成速率大约是30核苷酸/秒。

第二节基因工程的分子生物学基础2、RNA的转录:

RNA的转录包括三个阶段：转录起始；转录的延伸；转录的终止。原核生物中RNA转录的起始过程。主要步骤为：封闭二元复合体的形成→开放二元复合体的形成→三元复合体的形成→RNA合成起始。第二节基因工程的分子生物学基础第二节基因工程的分子生物学基础DNA结合DNA解链形成硫酸二酯键释放σ因子σ因子全酶封闭的二元复合物开放型二元复合物三元复合物RNA合成开始RNA转录的起始过程RNA聚合酶的δ因子是识别启动子序列的主要因子，不同的δ因子使RNA聚合酶识别不同的启动子序列。（二）RNA转录后加工在原核生物中，mRNA经聚合酶从模板DNA链上转录下来以后，就是成熟的mRNA，不需要转录后加工，而且在原核生物中mRNA的转录与翻译即合成蛋白质的过程是偶联在一起的，mRNA边转录，而蛋白质也边合成。但由于真核生物中为蛋白质编码的DNA序列是不连续的，整个基因序列由所谓外显子和内含子所组成，在核质中被RNA聚合酶Ⅱ合成的初级转录物（primarytranscripts）又叫做核不均一RNA

（hnRNA），在核中要经过一系列的修饰、加工后才形成成熟的mRNA。第二节基因工程的分子生物学基础两种策略1mRNA在转录刚刚开始，大约30个核苷酸被合成时，在鸟苷转移酶的催化下，GTP同RNA转录物5′三磷酸末端之间发生缩合反应，在RNA转录物的5′端加上G残基的帽子，这种帽子结构将在蛋白质的合成的起始过程中发挥重要作用，同时也保护了RNA转录物，避免合成过程中被降解。第二节基因工程的分子生物学基础在3′端加上poly-A。这一修饰过程的特征是，通过识别RNA分子3′端的AAUUAAA共有序列，在此序列下游10～30个核苷酸处将正在转录的RNA切断，在poly-（A）聚合酶的催化下，在3′端切点处加上由100～200个腺苷酸组成的多聚腺苷酸（poly-（A））尾。此时，初级转录物的合成才结束。一个典型的初级RNA转录物（或hnRNA），其5′端含有帽子，其3′端具有poly-（A）。两种策略2第二节基因工程的分子生物学基础CapCapRNA聚合酶起始继续在AUUAAA之后很快切割poly（A）加到3´端AAUAAA序列与poly（A）序列的加入第二节基因工程的分子生物学基础Poly（A）的功能：

①协助成熟的mRNA从细胞核向细胞质转运；②提高mRNA在细胞质中的稳定性；③作为核糖体的识别信号，使mRNA得以有效翻译。现在认为，Poly（A）对基因的表达调控有重要作用。在基因工程的操作方面，Poly（A）的存在为我们利用oligo-dT或poly（dT）亲和柱，通过碱基互补原理从细胞RNA中分离hnRNA和mRNA，进而获得所需的cDNA创造了条件。第二节基因工程的分子生物学基础五、逆转录和逆转录酶逆转录（reversetranscription）是对于转录而言的。即以RNA为模板在逆转录酶的催化下合成DNA的过程。逆转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板。逆转录酶是被逆转病毒（retrovirus）RNA所编码，在逆转病毒的生活周期中，负责将病毒RNA逆转录成cDNA，进而成为具双螺旋的DNA/DNA，整合到宿主细胞的染色体DNA中。利用逆转录酶所建立的cDNA文库（cDNAlibrary）为基因的分离和重组提供了重要的技术手段，如近年来发展起来的逆转录—多聚酶链反应（RT-PCR）就是一大突破。第二节基因工程的分子生物学基础第二节基因工程的分子生物学基础mRNA↓

退火的引物↓

↓

↓

↓

用反转录酶制备DNA拷贝用碱处理以降解RNADNA聚合酶用发夹环作引物合成互补DNA链cDNA的3′端形成发夹环用S1核酸处理切开发夹环原本的mRNA的双链cDNA拷贝cDNA的合成原理六、翻译—蛋白质的生物合成通过转录将贮存在DNA分子中的遗传信息传递给为蛋白质编码的mRNA，翻译就是将以核苷酸形式编码在RNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序。遗传密码UAA、UAG、UGA不为氨基酸编码。遗传密码的特性：（1）遗传密码的通用性。（2）遗传密码的兼并性（一个氨基酸有一个以上的密码子为其编码）。遗传密码的兼并性有何作用？第二节基因工程的分子生物学基础（3）遗传密码使用的偏倚性（codonusagebias）。遗传密码的兼并性决定了一个氨基酸可以有不只一个密码子为其编码。然而，在蛋白质生物合成时对兼并密码子使用的频率是不同的。（4）密码子的不重叠性和阅读方向。密码阅读的方向与mRNA编码的方向相一致，是从5′→3′。（5）应注意到在酵母、无脊椎动物、脊椎动物的线立体中的遗传密码同遗传密码表相比出现一些偏离。如UGA不再是翻译终止密码子，而是为色氨酸编码。第二节基因工程的分子生物学基础七、基因表达的调控由于真核基因具有比原核基因复杂得多的组织结构特点，其基因表达的调控要复杂得多。在真核细胞中，对为蛋白质编码的基因的表达，可以在六个环节上进行调控：

（1）转录水平上的调控；（2）转录后的调控，也就是初级转录物的剪接或加工；（3）RNA转运调控，即在细胞核中加工好的mRNA的细胞质转运的调控；（4）翻译水平上的调控；（5）mRNA降解的调控；（6）翻译后的加工，即蛋白质活性控制。第二节基因工程的分子生物学基础真核基因表达调控的六个阶段①转录调控，②RNA加工，③RNA转运，④翻译水平调控，⑤mRNA降解的调控，⑥蛋白质活性的调控。第二节基因工程的分子生物学基础蛋白质活力控制蛋白质失活蛋白质细胞核mRNA降解控制细胞质失活mRNA最初RNA转录物转录控制RNA剪切控制DNAmRNAmRNARNA运输控制转译控制①

②③④⑤⑥第三节基因工程的四大要素及实施要点第二章基因工程α-淀粉酶α-淀粉酶是淀粉水解酶，又称液化酶，它可把淀粉水解成糊精和糖，使淀粉糊粘度迅速下降。真菌α-淀粉酶的最适作用温度为55℃左右，超过60℃开始失活。细菌α-淀粉酶的最适作用温度高，中温α-淀粉酶70～80℃。如何改进？现发现一种嗜热脂肪芽孢杆菌能分泌一种耐热性的α-淀粉酶，这种菌培养条件苛刻。怎么办？基因工程的基本过程生物材料mRNADNADNAcDNA文库基因组文库人工合成

目的基因

克隆载体重组DNA受体细胞重组子转基因生物工具酶一个完整的基因工程包括：基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞中的保持、转录、翻译表达等全过程。基因工程四个必要的条件：基因工程又称重组DNA技术，其实施要有四个必要的条件：工具酶、基因、载体、受体细胞。基因工程的基本过程基因工程的基本过程施工工材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。目的基因与载体DNA的体外重组（连接）。形成重组DNA分子。把重组的DNA分子引入（转化）受体细胞，并建

起无性繁殖系（增）。筛选（检）出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。（切、接、转、增、检）一、工具酶一、工具酶定义：基因工程操作中，以一些重要的酶（如限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶等）作为工具对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶（enzymeoftools）。一、工具酶工具酶的种类核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶一、工具酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA断口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶I①合成双链cDNA的第二条链②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3’末端反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3’羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基一、工具酶（一）限制性内切酶限制酶的概念限制酶概念提出的背景限制性内切酶的分类限制性内切酶的命名规则限制性内切酶的性能限制性内切酶的用途一、工具酶一、工具酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA一、工具酶1、限制性内切酶（resteictionendonuciease，RE）的概念指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。特点：能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性DNA片段。存在于细菌体内。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值“分子手术刀”。一、工具酶NNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNAluINNNNAGCTNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNAGCTNNN（－）（＋）电泳一、工具酶2、限制酶概念提出的背景E.coliK株噬菌体E.coliK株其它E.coli菌株限制现象一、工具酶20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E.coliK株的噬菌体只能感染E.coliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶。一、工具酶E.coliK株噬菌体限制性内切酶E.coliK株能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。一、工具酶NNNNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNBamHINNNNNNNNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNN5’3’AluI5’3’一、工具酶3、限制性核酸内切酶的分类根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。I型：分子质量较大的多功能酶。需Mg2+/ATP/SAM。随机切割。不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。Ⅱ型：分子量较小的单功能酶。无/只需Mg2+。特异性地切割。特别适合基因工程的工具酶。Ⅱ型：Ⅲ型：双功能酶。切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp～27bp，需较多的辅助因子。对分子克隆操作亦无实用意义。一、工具酶4、限制性核酸内切酶的命名原则待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则。名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。一、工具酶限制酶由三部分构成，即：菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ—HaemophilusinfluenzaedⅢ前三个字母来自于菌种名称Haemophilusinfluenzae，“d”表示菌系为d型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢ

SacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)流感斜体一、工具酶5、Ⅱ类限制性核酸内切酶的性能（1）一般性状分子质量为60ku，单链多肽，最适pH为6～8；NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用，对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃

环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。一、工具酶（2）限制性核酸内切酶的作用机制5’-pppppppppACAGCGCTTTGTCGCGAAo-3’3’-oppppppppp-5’限制性核酸内切酶5’-pppppppppACAGTGTCGCo-3’3’-oppppppppp-5’OHCGCTTGAA+一、工具酶（3）识别序列它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是

4bp

～6bp，有些则为7bp～8bp，甚或多于8bp。多数限制酶的识别序列为回文结构（即识别序列常呈旋转对称性）。莺啼岸柳弄春晴，柳弄春晴夜月明。明月夜晴春弄柳，晴春弄柳岸啼莺。一、工具酶一、工具酶GTTAAC5’3’HapICAATTG3’5’GAATTC5’3’EcoRICTTAAG3’5’AAGCTT5’3’HindIIITTCGAA3’5’一、工具酶识别序列的表示方法：识别一种序列的：在识别序列以一条链表示时，按

5’→3’的方向列出；“N”可表示A、G、C或T。BglI5’GCCNNNNNGGC3’识别多种序列的：HindIII5’CTyuAC（y为C或T，u为A或G）TaqIIGACCGA和CACCCA。u=A或Gs=C或G,r=A或C,y=C或T,h=A或C或T,w=A或T,d=A或G或T,n=x=A或C或G或T一、工具酶（4）切割位点切割位点一般与识别序列一致。大多数II型限制性内切酶在其识别序列内切割DNA。有些则在距其识别序列附近一定长度的位置切割

DNA，其具体切割位置“↓”用圆括号内的数字表示。

HgaI：GACGC（5/10）即表示其在如下位置切割：5’GACGCNNNNN↓3’3’CTGCGNNNNNNNNNN↓5’一、工具酶（5）切割方式根据双链DNA被切割所成的末端，一般分为三种：在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切割磷酸二酯键，形成双链平齐末端。GTTAAC5’3’HapICAATTG3’5’一、工具酶在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从

5’端切割磷酸二酯键，形成5’-磷酸端2-5个核苷酸突出单链黏性末端。GAATTC5’3’CTTAAG3’5’ppEcoRIGAATTC5’3’CTTAAG3’5’一、工具酶在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从

3’端切割磷酸二酯键，形成3’-羟基端2-5个核苷酸突出单链黏性末端。CTGCAG5’3’GACGTC3’5’OHOHPstICTGCAG5’3’GACGTC3’5’一、工具酶平齐末端黏性末端切割方式粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子。GAATTC5’3’CTTAAG3’5’ppEcoRI一、工具酶（6）同裂酶和同尾酶同裂酶（isoschizomer）：来源不同而识别序列和切割方式均相同的II型限制性内切核酸酶。HpaIIMspICCGGCCGG一、工具酶同尾酶（isocaudamer）：虽来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同的黏性末端的II型限制性内切核酸酶。

BamHI5’GGATCC3’5’GGATCC3’MboI5’GATCC3’5’GGATCC3’SalI5’GTCGAC3’5’G+TCGAC3’一、工具酶需要指出的是：由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是由此连接形成的重组DNA分子往往不能被原来的同尾酶中的任何一种重新切开，即原来的同尾酶的识别序列都已不再存在。XhoI5’CTCGAG3’

5’C+TCGAG3’

连接5’CTCGAC3’5’GTCGAG3’一、工具酶同尾酶的DNA酶解片段都可以在体外重组，在连接酶的作用下，得到的嵌合DNA。异源二聚体:5’NNNNNNCTCGACNNNNNNNNN

3’这种异源二聚体由于不再被原来的限制性内切酶识别，有利于得到大量的重组DNA分子，在基因工程中很重要。3’NNNNNNGAGCTGNNNNNNNNN

5’一、工具酶（7）稀切酶（rarecuttingenzymes）识别DNA分子中低出现几率的长的和富含GC或富含AT的序列的相应的限制性内切酶。

λAd2SV40φ174NotIGCGGCCGC0700一、工具酶（8）限制性片段长度与切割频率限制性片段长度(restrictionfragment):经限制性内切酶切割后产生的DNA片段。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一。一、工具酶切割频率：假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为Y，那么，某限制性酶在该DNA分子上的切割位点出现的频率，用F表示。F=XnYm

式中：n——该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m——该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目。一、工具酶如果构成某DNA分子的碱基对总数目（B）及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割为点数目（N）为：N=BF

显然，上述的假设是以生物体DNA中核苷酸排列随机性为前提的。然而，实际情况往往与上述理论值不尽符合。一、工具酶例如，理论上，40kb的T7噬菌体DNA上应各有BamHI、EcoRI、HindIII（均属识别序列、切割位点为6个碱基对的限制酶）的切割位点10个，但实际上1个也没有。Why？实际上，DNA分子中限制酶的识别序列及切割位点的分布并不是随机的，而是按遗传学特性集中出现在结构基因的前后。一、工具酶例如，在36kb的pSa因子中，6个碱基对的识别序列及切割位点集中于其四个抗药性基因的10kb范围内，而其余26kb的DNA片段与质粒复制和转录有关，仅有几个6个碱基对的识别序列及切割位点。此外，真核生物DNA含GC碱基对的数目相对较少，因此，一些限制酶在真核生物DNA分子中切割位点的出现频率远低于在原核生物DNA分子中切割位点的出现频率。一、工具酶值得指出的是，识别位点为四个碱基对的限制酶的切割位点实际出现频率与理论计算预测频率常较一致。有些组的同尾酶中一些限制酶识别四核苷酸序列，一些限制酶识别六核苷酸，并且那些四核苷酸序列常包含于那些六核苷酸序列中。MboISau3A

BamHIGATC

GGATCC一、工具酶在基因工程中，可以利用四核苷酸识别序列与六核苷酸识别序列在DNA分子上出现频率的不同，选择合适的限制酶酶解DNA，获得大小合适的限制性片段，插入合适的载体形成重组DNA分子，导入适当受体细胞复制、表达。一、工具酶6、影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略（1）底物DNA制备物的纯度：①增加限制酶的用量;②延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；③扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；④在反应液中加入适量亚精胺（一般应用浓度为1-2.5mmol/L），以利限制酶对基因组DNA的酶解。但在4℃下，亚精胺会使DNA沉淀，因此，必须将反应液于适当温度下保温数分钟后再将其加入。为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法：星星活性在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割与识别序列，这个改变的特殊性称星星活性。（2）底物DNA的甲基化程度：限制作用和修饰作用许多细菌例如大肠杆菌等具有一种类似免疫的防卫系统，即限制与修饰系统（R-M系统）。限制作用是指一定类型的细菌可以通过其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的现象。修饰作用是指在DNA甲基化酶作用下，生物体自身DNA分子在特定碱基的特定位置上发生甲基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解的现象。一、工具酶大肠杆菌的绝大多数菌株含有三种DNA甲基化酶：①dam甲基化酶②dcm甲基化酶特异地催化DNA分子中5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位置的甲基化。与此序列相关的限制酶只能部分酶解或完全不能酶解从正常大肠杆菌菌株中分离的底物DNA。催化DNA分子中5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的第二个胞嘧啶C5位置的甲基化。一、工具酶③EcoKI甲基化酶催化DNA分子中AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中的A的N6位置的甲基化。但因为识别位点少（1/8kb），所以研究较少。④SssI甲基化酶此酶来自原核生物螺原体(Spiroplasmasp.),可催化CG序列中的C在C6位置上甲基化。一、工具酶克服甲基化作用影响限制酶活性的方法如下：①用具有相同识别序列和切割位点，但不受甲基化作用影响的酶替代那些受影响而丧失作用的酶。②在没有相同功能的酶可以替代的情况下，或当需要在有多个识别位点酶的每一个位点处或有单个识别位点的酶完全酶解原核DNA时，必须从dam–

或dcm–的大肠杆菌菌株中提取所需的底物DNA；③利用的限制酶的识别序列中不含胞嘧啶的限制酶切割胞嘧啶甲基化程度高的底物DNA；④利用对某些位点特异性甲基化作用不敏感的限制酶对经某些甲基化修饰的底物DNA进行完全酶解。一、工具酶需要指出的是，在真核生物中，不会发生DNA分子中腺嘌呤N6位置的甲基化。因此，受dam甲基化作用影响的那些限制酶均可有效地使用。一、工具酶需要指出的是，在真核生物中，不会发生DNA分子中腺嘌呤N6位置的甲基化。因此，受dam甲基化作用影响的那些限制酶均可有效地使用。在基因工程中，可将限制酶不能切割甲基化核苷酸序列这一特性具体用于以下方面：。NNNNNNNGM6AATTCNNNNNNNGAATTCNNNNNNNGM6AATTCNNNNNNNGTTAAGM.EcoRIR.EcoRI①保护酶切位点一、工具酶③形成限制酶的新识别位点。②改变某些限制酶的切割特异性。HindIIGTCGAC\GTCAAC\GTTGAC\GTTAACM.TaqITCGATCGATaqI

TaqI

M.TaqI

TCGA*TCGADpnI

（3）底物DNA的结构构型：一、工具酶环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。需要指出的是，一些DNA分子中的一些特定酶切位点，只有在其他酶切位点被广泛切割的条件下，才能被有关限制酶所酶切。还有少数限制酶，对不同部位酶切位点的酶切活性有很大差异，有些位点是很难被酶切的。（4）酶反应缓冲液的组成：一、工具酶MgCl2、NaCl或KCl、Tris-HCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白等。二价阳离子（通常Mg2+）是限制酶表现正常活性所绝对需要的。使反应液的pH值稳定于酶活性所要求的最佳范围内。稳定酶一、工具酶需要指出的是，一些限制酶对于Na或K离子浓度变化反应十分敏感；而另一些限制酶则可适应较广的离子强度变化幅度。由于不同的限制酶对盐浓度要求不一，因此可将酶反应缓冲液配为高盐、中盐、低盐三类。当需要进行双酶解或两种以上限制酶酶切时，如果这些限制酶可以在同种缓冲液中作用良好，那么可用这些限制酶同时酶切。一、工具酶如果这些限制酶所要求的缓冲液有所不同，那么可以依次采用如下方法进行酶切反应：①先用要求低盐缓冲液的限制酶酶解DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求较高盐浓度缓冲液的限制酶进行酶解；②先用一种限制酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一种缓冲液中进行第二次酶解；③使用所有限制酶均可表现活性的一种缓冲液。一、工具酶（5）酶反应的最适温度：大多数限制酶反应的最适温度为37℃，少数限制酶的反应温度高于或低于此温度。（6）酶解反应的操作步骤及注意要点。一、工具酶7、限制性内切酶的主要用途（1）在特异性位点上切割DNA，产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段。（2）建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱。（3）构建基因文库。（4）用限制性内切酶切除相同的粘性末端，以便重组DNA。一、工具酶应用2、酶切图谱的构建一、工具酶M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERE3、用于基因组文库的建立一、工具酶3、用于cDNA的连接CH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RERERERE一、工具酶在基因工程中，最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有:大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）、T4噬菌体编码的DNA聚合酶、T7噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。依赖于RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶。将核苷酸加到已有DNA分子的末端，即末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）。一、工具酶这些DNA聚合酶的共同特点是：它们都能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3´-OH末端，催化核苷酸的聚合，而不发生从引物模板上解离的情况。其中，T7DNA聚合酶的聚合能力最强。一、工具酶这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。1、大肠杆菌DNA聚合酶它主要有三种活性：（1）5’→3’DNA聚合酶活性---缺口翻译以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。3’ATGCAATTGC5’5’T