试验报告-果蝇基因组DNA的提取

四川大学实验报告果蝇基因组DNA勺提取果蝇基因组DNA勺提取姓名： 学号：一、实验目的.掌握动物基因组DNAt提的操作过程，了解基因组DNA1取的意义;.熟悉DNA1取的步骤和DNAfe泳原理。二、实验原理DNA是绝大多数生物（除少数RNAW毒外）记录、存储、彳^递遗传信息的载体；DNA的提取是进行PCFT增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的基础。细胞破碎 ►抽提去蛋白质 ►沉淀核酸三、实验试剂抽提缓冲液：100mMNaCl,10mMTris.Cl（pH8.0）,25mMEDTA（pH8.0）,0.5%SDS,0.1mg/ml蛋白酶K（新鲜加入）各成分的作用：NaCl,Tris.Cl:调节溶液的pH,维持一定的离子浓度；EDTA二价金属离子的螯合剂，使影响DNA勺DNA1中的钙离子和镁离子和EDTA吉合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA还可以防止镁离子与核酸生成沉淀。SDS去污剂，可溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，和核酸结合，减少和消除蛋白质杂质，保护DNA^受内源核酸酶的降解。50X电泳缓冲液TAE242gTrisbase,57.1ml冰醋酸，37.2gNa2EDTA?2H2Q力口ddH2O至1000ml。Nc2+:离子浓度太低时电泳速度变慢；EDTA二价金属离子的螯合剂，使影响DNA勺DNA1中的钙离子和镁离子和EDT阂合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA还可以防止镁离子与核酸生成沉淀。6XDNA上样缓冲液0.7%琼脂糖凝胶：0.28g琼脂糖，加入40ml1XTAE于电炉上加热至沸腾，待冷却至50c左右（手试微烫），加入2/DNA荧光染料，混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。为什么凝胶用的缓冲液是TAE溶液？因为电泳缓冲液是TAE那么用TAE配胶就使胶体中的离子环境与缓冲液相同，使核酸携带的电荷更稳定，条带更加清晰。四川大学实验报告题目：果蝇基因组DNA勺提取四、实验步骤1.10只果蝇放入1.5ml离心管，力口30口抽提缓冲液，用枪头迅速捣碎；抽提缓冲液：.加400口抽提缓冲液，混匀，65c温浴30min,每10分钟重新混匀一次；.加等体积（约430仙1）酚氯仿/异戊醇（25:24:1）,盖紧管盖，上下颠倒混匀2min,12,000rpm离心5min;酚：有机溶剂，能使蛋白质变性；氯仿：抑制核酸酶，提苯酚；异戊醇：可快速分层，去气泡；.上清转移至新的离心管中。加等体积（约400N1）异丙醇，轻轻混匀，静置2min。12,000rpm离心5min,弃上精液;异丙醇：能与自由水紧密结合，结合了溶解DNA勺水分子，使DNAC淀；.用400卜170%的乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min,弃上清液。沉淀自然干燥，力口入20仙lddH20s解；70叱醇：洗去异丙醇，且易于从DNAC淀中除去；.取2,4,6/DNA溶液，力口1-2口上样缓冲液，点样电泳，并观察电泳条带。五、注意事项.研磨迅速彻底，研磨好的材料应与抽提液充分混匀；.动作迅速避免核酸降解酶类的降解；.DNA荧光染料致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。.配置琼脂糖凝胶溶液时，要等溶液冷却后再加荧光染料，防止染料蒸发，使人中毒；.酚是淡黄色的，如果被氧化成酶，则变成棕色，不能继续使用；.第三步颠倒混匀时，要带手套，因为PE管有可能裂开；.整个过程操作要温和，不要剧烈震荡，防止DNAt裂；.乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂；六、讨论.为什么使用15000的Marker,而不是2000的Marker?答：因为目的基因大于15000bp，用15000的Marker更明显，更容易直观的比较提取的基因组DNAf15000bp的大小关系，从而判断实验的成败与否。.各种提取植物基因组DNA勺实验方法的比较？答：（1）通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA勺抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如琉基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。CATB勺原理：CAT%离子表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，第2页四川大学实验报告题目：果蝇基因组DNA勺提取与蛋白质结合，减少和清除蛋白质杂质，再通过后续实验将 DN的离出来即可。优点：对多糖的去除比较彻底；缺点：操作繁琐，实验时间长；SDS的原理：是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，与核酸结合，再通过后续实验将SDStf核酸分离，即可得到DNA优点：操作相对简单，时间短；缺点：对多糖的去除不彻底；（3）再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸 （DNARNA水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上精液中加入无水乙醇使DNAM淀，沉淀DNA容于TE溶液中，即得植物总DNA容液。尿素法：操作过程比较温和，不需要剧烈的震荡及高温的处理，不容易造成 DN侬性降解。此法提取的DN颇量最高且适用真菌的种类最多，同时该法的操作步骤少且完成全过程时间短，简单易行。.荧光染料嵌入DN的子的机理？答：荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共腕双键的化合物。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNAt段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。 DNAE碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA^b子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。荧光染料（GelRed,GoldView,EB等）可嵌入DNA^子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。.设计利用提取的果蝇基因组DNAa行各果蝇品种鉴定的实验方案---查资料。答：1.实验原理基因控制生物的性状，可以从基因的角度鉴别生物的不同品种；控制相对性状的基因称为等位基因，一般位于同一对染色体上；黑腹果蝇的基因组是已知的；序列相似性比较：就是将待研究序列与DNAE蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLASTFASTA等；多序列比对的意义：（1）用于描述一组序列之间的相似性关系，以便了解一个基因家族的基本特征，寻找motif,保守区域等；（2）用于描述一个同源基因之间的亲缘关系的远近，应用到分子进化分析中；（3）其他应用，如构建profile,打分矩阵等。2.实验方法多序列比对多序列比对的方法：同源性分析中常常要通过多序列比对来找出序列之间的相互关系，和blast的局部匹配搜索不同，多序列比对大多都是采用全局比对的算法。这样对于采用计算机程序的自动多序列比对是一个非常复杂且耗时的过程， 特别是序列数目多，且序列长的情况下

四川大学实验报告题目：果蝇基因组DNA勺提取多序列比对的分类：⑴手工比对（辅助编辑软件如bioedit,seaview,Genedoc等）：通过辅助软件的不同颜色显示不同残基，靠分析者的观察来改变比对的状态。⑵计算机程序自动比对：通过特定的算法（如同步法，渐进法等），由计算机程序自动搜索最佳的多序列比对状态。自动多序列比对的算法（1）同步法将序列两两比对时的二维动态规划矩阵扩展到三维矩阵。 即用矩阵的维数来反映比对的序列数目。这种方法的计算量很大，对于计算机系统的资源要求比较高，一般只有在进行少数的较短的序列的比对的时候才会用到这个方法。（2）步进法最常见的就是clustal所采用的方法。其基本思想就是基于相似序列通常具有进化相关性的这一假设。⑶Clustal的渐进比对过程：在比对过程中，先对所有的序列进行两两比对并计算它们相似性分值，然后根据相似性分值将它们分成若干组，并在每组之间进行比对，计算相似性分值。根据相似性分值继续分组比对，直到得到最终比对结果。在比对过程中，相似性程度较高的序列先进行比对而距离较远的序列添加在后面。两条序列的比对点阵法：如果两条序列相似度不是很高，因为点阵法能将所有可能的比对结果用该矩阵的（次）对角线表现出来。点阵法还能显示插入/缺失及序列内部正向和反向重复的存在，这是其它比对方法很难做到的。这种方法的局限在于大部分的点阵分析程序无法给出一个真正的比对结果。动态规划法：首先由计算机科学家提出来的一种算法，它从数学意义上保证结果是最优的。词或k用法：通过搜索序列间完全相同的一短用字符，然后通过动态规划法吧这些词语连接成比对结果。这类方法的优点是速度快，适合搜索整个数据库，寻找与待查序列比对结果最好的序列，得到比对结果在统计上是可靠的。2.实验思路提取各个品种的果蝇的基因组DNA -—一 根据已知的果蝇基因组序列，运用多序列比对技术找到控制一对相对性状的基因的位置 -—一 根据已知的果蝇基因组序列，运用多序列比对技术找到控制一对相对性状的基因的位置对所得基因组DNAS行序列相似性比较，找到控制一对相对性状的基因的位置运用两条序列的比对方法，鉴别控制一对相对形状的基因的序列与控制一对相对性状的基因组DNAs对应的果蝇即为同一品种

四川大学实验报告题目：果蝇基因组DNA勺提取七、实验结果及分析果蝇基因组DNAI取结果：实验结果分析:Marker:DL1500dM实验结果分析:—15000- 10000—7500—5000—2500——1000 250.Marker带：M泳道的Marker与预期结果相符合，出现7个为15000bA10000bp7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp条带，但是出现拖带现象；.泳道1、2、3号：为提取的果蝇基因组DNA1、2、3号泳道分别加入了2口、4口、6口的样本，三个泳道均跑出了2个条带，且出现拖带现象，其中第二条带拖带较严重；第一条带位于15000bp上方，亮度较小，是提取的果蝇基因组DNA表明提取的较成功；第二条带位于250bp的下方，亮度大，是提取过程中的RN躲质；由于三个泳道加入的样本量依次增多，第一条带的亮度应该依次增大，但是实验结果中亮度变化并不明显原因分析：(1)可能是加样时，有部分样本漂出；(2)样本浓度过低，亮度差别不明显；四川大学实验报告题目：果蝇基因组DNA勺提取参考文献：[1]杨大鹏主编.遗传学实验，基因频率的分析，2010年9月.[2]汤文开，谭新，张辉，黄耿青，徐文亮，李学宝，一种快速简单高效提取植物 DNA勺方法，华中师范大学学报(自然科学版)，第41卷第3期2007年9月[3]魏志刚，王艳敏，杨传平，松科植物基因组总 DNA1取方法的比较，生物技术通讯， Vol.18No.2Mar.,2007[4]曹文波，郑璐璐，谢文海，一种提取植物基因组 DNA的方法一改良尿素法，华中师范大学学报(自然科学版)，第42卷第3期2008年9月[5]《关于果蝇的眼色遗传的认识》[6]《果蝇嗅觉基因筛选、鉴定及其功能研究》[7]《12种果蝇基因组对比研究完成》黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和拟暗果蝇(D.pseudoobscura)的基因组是已知的；论文分别发表在 2000年和2005年的《自然》杂志上。可以访问 NHGR贯助的果蝇数据库：, 关于果蝇基因组序列，也可以访问美国国立生物技术信息中心 NCBI(,)或以下两个数据库：EMBL-Bank(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html, )和DDBJ(www.ddbj.nig.ac.jp,)[8]《已完成基因组测序的物种》动物阳葡«AnopneieS力由丽丽-疟蚊Apism&fi/fafa-蜜蜂B05植umc&t