生化药物与基因工程药物分析

关于生化药物与基因工程药物分析第1页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

第一节概述

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第一节概述

第一代生物药物：生物体某些天然活性物质加工制成，例如胎盘制剂第二代：利用生化技术从生物材料中分离、纯化获得的，例如纯化胰岛素第三代：利用生物技术生产的天然生化物质及经过生物工程手段改造的新物质第3页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五一、生物药物的概念利用生物体、生物组织或器官等成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制的的一类药物广义：从动物、植物、微生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物第4页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（一）生化药物：利用生物化学的理论、方法和技术，从动物、植物以及微生物等生物体中提取分离的天然活性物质，以及这些物质及其衍生物的化学合成、半合成和现代生物技术制的的产品。例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。第5页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（二）生物技术药物生物技术：利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，生物技术作为一种手段可用以研究和开发新药。生物技术药物（生物工程药物）：用生物技术研制的药物第6页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（三）基因工程药物先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制蛋白质合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质第7页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（四）生物制品应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物或人源组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的药品。第8页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五生物制品的分类预防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、类毒素（破伤风类毒素）治疗：特异性治疗用品（狂犬病免疫球蛋白）、非特异性治疗用品（白蛋白）诊断：免疫诊断用品（结核菌素）第9页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

1.生物体的基本生化成分

来自生物体，参与、调控和影响人体代谢和生理功能，在某些疾病治疗时具有针对性强、毒副作用小的特点。部分蛋白质药物，极微量就可产生显著效果。

2.分子量大:

分子量一般为几千至几十万，结构复杂，甚至不确定，分析和检验困难，常需纯度分析和分子量测定。

二、药物治疗控制的特点第10页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3.结构难确证：各种技术

4.全过程的质量控制：

对酸、碱、热、pH等敏感，严格控制实验条件和鉴定质量。基因工程药物比传统工艺生产的药物要求更高。

5.生物活性检查

多肽、蛋白质类药物，除采用理化检验外，还需采用生物鉴定法证实其生物活性。

二、药物治疗控制的特点第11页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五6.安全性检查

热源检查、过敏实验、致突变实验

7.效价（含量）测定：

理化法：生物药物和基因工程药物

效价测定和活性测定：酶类药物

二、药物治疗控制的特点第12页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第二节质量控制的项目和方法来源和种类性状鉴别检查含量测定第13页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

一、鉴别试验

理化鉴别法：化学鉴别法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鉴别法：酶法

电泳法

样品脱盐后等电点聚焦法测定

生物鉴别法：血清学法

生物学法第14页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（一）理化鉴别法

1.化学鉴别法：

例：溶菌酶+Cu2+络合显色第15页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

2.紫外分光光度法

最大吸收波长固定不变，紫外光谱图一致

溶剂：0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠浓度：20μg/ml

判断：λmax：257±1nm

3.HPLC法：

利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。

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（二）生化鉴别法1.酶法：例：尿激酶的鉴别气泡上升法原理：第17页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

方法：取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法操作，凝结块在2小时内不溶。第18页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五2.电泳法：带电荷的供试品在惰性支持介质中，与电场的作用下，按各自的速度向其对应的电极方向泳动，使组分分离成狭窄的区带。第19页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五2.电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。第20页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3.

样品脱盐后等电点聚焦法测定基因工程药物等电点不一致同一产品，不管有几个等电点，批与批之间必须一致第21页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（三）生物鉴别法1.血清学法体外的抗原抗体试验。经典血清学反应：凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶标记等高敏感的检测技术第22页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

2.生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。第23页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五

一般杂质检查：氯化物、硫酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度等特殊杂质检查：原料药纯度分析和生产过程中杂质的检查二杂质检查第24页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（二）特殊杂质检查1.原料药的纯度分析多糖类纯度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白质2.生成过程中杂质的检查有传统生产方法不可能存在的有害杂质，如内毒素、致敏原第25页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五生化药物和基因药物的含量表示方法：

百分含量：适用于结构明确的小分子药

物或经水解后变成小分子的

药物。

生物效价或酶活力单位：适用于酶类、

蛋白质类药物。

三、含量（效价）测定第26页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第三节定量分析方法理化分析法生化测定法生物检定法第27页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五一、理化分析法（一）化学分析法重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。滴定分析法：根据生物制品中某些成分能与标准溶液定量的发生酸碱中和反应、氧化还原反应等特性，通过滴定过程而进行生物制品的含量测定的方法第28页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（二）电化学分析法电化学分析法：建立在物质在溶液中的电化学性质基础上的一类仪器分析方法，通常将试液作为化学电池的一个组成部分，根据该电池的某种电参数（如电阻、电导、电位、电流、电量或电流-电压曲线等）与被测物质的浓度之间存在一定的关系而进行测定的方法。第29页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（三）光谱法1.比色法供试品中某些成分可与显色剂发生颜色反应，根据颜色的深浅，与标准液进行同法处理后比较，即可测定含量。例：蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应第30页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（三）光谱法2.紫外分光光度法：生物制品或相关的反应产物的紫外光谱在某一特征波长处有最大吸收，且一定的浓度范围内与相应的吸光度成正比，则可用于生物制品的含量测定第31页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（三）光谱法3.荧光分光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。该法灵敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3个数量级)，选择性好。第32页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（四）高效液相色谱法具有高效分析、灵敏检测、操作简便的优点分离过程中不破坏分离样品的特点适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生物制品的定量分析第33页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五二、生化分析法

（一）酶法以酶为分析对象的分析：酶活力测定法目的是测酶的活性或活力以酶为分析工具或分析试剂的分析方法：酶分析法主要测定样品中酶以外其他物质的含量第34页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五1）基本概念：

酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。

酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。

1.酶活力测定法第35页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五1）基本概念：

酶单位：任何一种酶，在25℃以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位（国际单位，IU）

1.酶活力测定法第36页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五1）基本概念：

酶的比活性：为每毫克蛋白质所具有的酶单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。

1.酶活力测定法第37页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五酶反应进程曲线纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。

酶浓度曲线纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。

第38页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五2）酶促反应的条件及影响因素

底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。

pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、

适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。

温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或

37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。

辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要

相应的辅酶。第39页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3）测定方法：取样测定法、连续测定法取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据底物和产物在化学性质上的差异，用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续监测的方法。第40页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五4）酶活力测定的方法检测方法：紫外-可见分光光度法旋光法荧光分光光度法电化学测定法酶偶联测定法离子选择性电极测定法等。

第41页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五2.酶分析法

分析对象是酶的底物、辅酶活化剂、酶的抑制剂。

1.动力学分析法

2.总变量分析法本法又称为平衡法或终点法。

仅适用于底物的测定。第42页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五（二）电泳法

电泳法可分为三大类：自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳（HPCE)。

根据所用支持物的不同分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、PAGE法、SDS法、琼脂糖凝胶电泳法

第43页，共50页，2022年，5月20日，8点37分，星期五1、自由界面电泳：在一根U形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。第44页，共50页，2022年，5月20日，8点37