食品微生物限度检查标准操作规程

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微生物限度检查法

一 细菌、霉菌和酵母菌计数

简述

细菌，霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。

细菌、霉菌、酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生

长繁殖而成。因此供试品中所测的菌落数，实际为菌落形成单位数（colonyformingunitycfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。

在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。

设备、仪器及用具

设备

无菌室

结构和要求 无菌室应采光良好，避免潮湿，远离厕所及污染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作间组成。

操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁，天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（2～2.5w/m3）,并应定期检查辐射强度，在操作面上不得低于40uw.cm-2。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。

温度、湿度 室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果故温度应控制在18～26℃，相对湿度45～65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯，空气洁净级别不同的相邻房间的静压差应大于5Pa，洁净室与室外大气的静压差应大于10Pa。

操作间操作室应安装空气除菌过滤的单相流空气装置，洁净度不应低于10000级，局部净化度为100级，并准备药物天平、乙醇灯、火柴、75%乙醇棉、碘伏棉等。

缓冲间 缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂务。

尘粒数/m3

浮游菌（个）沉降菌（个）

结晶级别

微粒直径

≥0.5μm

微粒直径

≥5μm

／m3

／（∮

90mm.0.5h）

100级

≤3，500

≤0

≤5

≤1

10000级

≤350,000

≤2000

≤100

≤3

100000级

≤3,500,000 ≤20,000

≤500

≤10

洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测定方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

沉降菌数测定（II法）

无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长）以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。

有条件的单位，同时应检查无菌操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗净过滤系统中的过滤器，必要时予以更换处理。

消毒处理在每次操作前、后，用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。

阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。

无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。

仪器

2.2.1恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（20～25℃）微波炉、匀浆仪（3000～8000r/min）或康氏震荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、离心机、离心管、0.45μm滤膜及滤膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定。

菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平或天平（感量0.1g），PH系列比色计。

玻璃器皿锥形瓶（250～300ml，内装玻璃珠若干；500ml,1000ml）、培养皿（9cm）、量筒（100ml,500ml）、试管（18mm

×180mm、28mm×198mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20mml或30ml）、注射针头、载玻片、玻璃消毒缸（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或

牛皮纸袋中。锥型瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干或160℃干热灭菌2h，备用。

用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。

接种环（白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。

试液、稀释剂和试剂

试液

0.1%苯扎溴铵溶液或其它适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。

5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。

75%乙醇溶液

碘酊或碘伏溶液

稀释剂和试剂稀释剂配制后，高压蒸汽灭菌法灭菌。

0.9%无菌氯化钠溶液（附录3.1）

PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（附录3.2）

无菌聚ft梨酯-80氯化钠-溶液（3.4）

PH6.8无菌磷酸盐缓冲液

PH7.6无菌磷酸盐缓冲液按药典附录XVD配制后，过滤，分装，灭菌。

无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附录2.15）

无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）（附录3.5）4培养基

营养琼脂培养基（附录5.2）

玫瑰红钠琼脂培养基（附录5.3）

酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（附录5.4）培养基制备注意事项：

采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。

配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。

培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。

培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。

灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止被污染，可在三周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。制备好的培养基放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。

用水浴或微波炉加热熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用。培养基不能反复加热熔化。5供试品抽样、保存及检验量

抽样

一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复试或留洋观查）。

抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。

凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。

保存

供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。

供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。

检验量

所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药蜜丸需取自4丸、膜剂需取4片以上）。

固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。

液体制剂检验量为10ml。

膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为25cm2，化学药及生化药膜剂检验量为50cm2。

特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。6试验准备

将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所有物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。

开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。

关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。

操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）

擦拭供试品、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。

供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备若需用水浴加热时，温度不应超过，45℃，30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：

液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚ft梨酯-80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

固体、半固体或粘稠供试品称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/、2～4min）或其它有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚ft梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎，放入匀奖杯。

非水溶性供试品

软膏剂、乳膏剂 称供试品5g（5ml），加入含已灭菌溶化并保温45℃左右的司盘-805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚ft梨

酯-8010g混合物的烧杯中，立即用无菌玻棒搅拌均匀后，分次少量漫漫加入45℃的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。

油剂取供试品10ml，加入无菌聚ft梨酯-805～8ml，摇匀，再加入pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml。

栓剂称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，置45℃水浴保温10min，使溶，加入无菌聚ft梨酯-805～8ml，振摇使之乳化，再加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（稀释剂和聚ft梨酯-80总量为100ml），摇匀。

眼膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，以滤膜过滤法过滤除菌。滤器在140℃干热灭菌2小时，或用集菌仪除菌和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为供试液。7.4非水溶性膜剂供试品 化学药膜剂一般取样为100cm2 ，置灭菌锥形瓶中，加入适量的PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，于45℃±1℃水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取50cm2，剪碎，加入适量的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（通常1cm加1ml或2ml），

浸泡，振摇,以供试品浸液作为供试液。

肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为供试液。

气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰箱冰冻室内约1h，取出，速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成份，加适量无菌聚ft梨酯-80液）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。

茶剂取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇2～3min，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。

以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂的量，制成1：20～1：100供试液。

具抑菌活性的供试品

当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，在依法检查。常用的方法如下：

稀释法取规定量供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数

时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。

离心沉淀集菌法取规定量供试液，3000r/min，离20min，

弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。如供试液中有不溶颗粒、沉淀，先用500r/min，离心5min，留离心沉淀物，

取全部上清液按上述再离心，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。

薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌记数10.2。

中和法 凡含汞、砷或防腐剂等的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。

供试液的稀释 （10倍递增稀释法）

取3-4支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。

另取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液的试管中，（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）混匀，即为1：100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：102、1：103、1：104等适宜稀释级（3～4级）。

每递增1稀释剂，必须另换一支吸管。

在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁，调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。

记数方法验证

由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。验证时，按供试液的制备的细菌、霉菌和酵母菌记数所规定的方法进行。对各实验菌的回收率应逐一进行验证。

验证用菌株:大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102],

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003],枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501],白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]，黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁

培养基中，培养18～24h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5～7h天。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含50～100cfu的菌悬液。

验证方法 验证实验分四组，至少应进行3次独立的平行实验，并分别计算供试品组的对照组实验的菌回收率。

试验组 取最低稀释级供试液，按每1ml供试液加50～100cfu实验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法记数时，取实验菌液、供试液1ml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法记数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入实验菌。

菌液组 取上述实验菌液，测定其加入的实验菌菌数。

供试品对照组 取最低稀释级供试液1m，按菌落计数方法测定其所含菌数。

稀释剂对照组 为考察供试液制备过程对微生物的影响程度，可用相应的稀疏液替代供试液，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50～100cfu，按实验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

9.2.5

试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数

试验组的菌回收率（%）= ×

100%

菌液组的平均菌落数

9.2.6

稀疏剂对照组的平均菌落数

稀释剂照组的菌回收率（%）= ×100%菌液组的平均菌落数

结果判定稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则可按该供试液制备方法和菌落计数方法测定供试品的细菌、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率均低于70%，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。

验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

注意事项

所用标准菌种的传代数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转种培养，其培养物为第一代。

黑曲霉菌的菌液制备将黑曲霉菌的孢子接种至真菌琼脂斜面培养基斜面上，于20～25℃培养5～7天，使大量的孢子产生。加入3～5ml的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后，用一支10ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子菌液至无菌试管内，用比浊法，将菌液稀释至每毫升含10～100cfu。

做试验菌的回收率试验时，加入菌量以50～100cfu为宜。加菌量过多，如小于30个，则误差大。

检查法

平皿法

在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸

取各级稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级时可用1支吸管），每一稀释级注2～3个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。一般取适宜的连续2～3个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。

阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释剂（PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。

倾注培养基 将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体

制剂用的玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂（酵母菌）熔化，冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，置操作平台上待凝。

在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。

培养 一般细菌计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养48h。霉菌、酵母菌计数平板倒置于20～25℃培养箱中培养72h。

菌落计数

一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。

供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并需观察菌落特征及染色形态。

供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计。

若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时

仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辩菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。

记录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级2或3个平板菌落的平均数。当菌落数在15以上的同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，7～17，8～18，9～19,10～20。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。

菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24h，霉菌点

计需在48h作初步点计（点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。

在48h点计细菌，72h点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间5～7天，再点计菌落数。

对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。

含蜂蜜及王浆的合计按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按YPD琼脂平板点计酵母菌菌落数，二者合并为霉菌及酵

母菌数。

在特殊情况下，若营养琼脂培养基上生长有霉菌及酵母菌其数量多于玫瑰红钠琼脂培养基生长有霉菌及酵母菌，或玫瑰红钠琼脂培养基上生长的细菌数多于营养琼脂培养基上生长的细菌数，以菌落数多的培养基中的菌数报告结果。

菌数报告规则

宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为报告菌数的依据。

当仅有1个稀释级平均菌落数符合上述规定，以该级稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告（见附表例10.1.6.1）。

当有2个相邻稀释级平均菌落数符合上述规定时,视两者比值而定。若比值小于或等于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数均值报告菌数；当比值大于2不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告菌数（见附表附10.1.6.2,10.1.6.3）；当出现比值大于5，甚至高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因在进行检查，必要时，应进行方法的重新验证（见附表附10.1.6.4,

10.1.6.7）。

高稀释级平均菌落数×稀释倍数

（比值= ）

低稀释级平均菌落数×稀释倍数

当各稀释级平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数（见附表10.1.6.5）。

如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的

平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于10报告菌数

（见附表10.6.6）。

附表：细菌数报告规则举例各稀释级菌落数

规则 原液 比值 菌落数 报告数

1：10 1：102 1：103

10.1.6.1 不可计 164 20 — 16400

16000

10.1.6.2

不可计

315

46

1.6

37750

38000

10.1.6.3

不可计

271

60

2.2

27100

27000

10.1.6.4

39

41

4

10.2

异常

10.1.6.5

24

19

12

—

240

240

10.1.6.6

0.5

0

0

—

5

＜10

10.1.6.7

27

27

0

*

*

*培养基稀释法测定

薄膜过滤法

取滤膜孔径大于0.45μm，直径不小于50mm可拆卸的滤器。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每

张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀释剂中，混匀，过滤。若供试品1g或1ml含菌较多，可选适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用PH7.0无菌氯化钠

—蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗量及冲洗方法同“计数方法验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则一影响微生物生长。

阴性对照试验 取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

培养和计数 培养及菌落计数方法同平皿法，每片滤膜上的

菌落数应不多于100个。如菌落数超过100个，不便计数时，可取高稀释级的供试液同法操作，点计滤膜上的菌落数。

菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品）或<1乘以稀释倍数的值报告菌数。

培养基稀释法：

取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。

每1ml供试液等量分注5个或5个以上平板点计的菌落之和，即为每1ml菌落数，共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数的值报告。

结果报告

菌落数在100以内时，按实有数据报告。

菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。

复试

供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应

从同一批样品中随机重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。若三次结果的平均值不超过该品种

项下的规定，判供试品符合规定；否则，判供试品不符合规定。11注意事项

供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1h。否则，可导

致微生物死亡而影响计数结果。

供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造成实验误差。

为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：

开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机1～2h后合盖。放入培养箱培养。

换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。

加TTC于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml（最终浓度为0.001%），混匀后倾注平皿。

12检验报告书写

本品按《中国药典》2005年版微生物限度检查法标准检验，结果符合或不符合规定。

细菌

霉菌

酵母菌

附表：细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂板）

大小

差别很大，在同一平

一般较大，亦有细小的

多数直径为1~2mm，在

板上可出现针尖大

菌落。在同一平板上生

同一平板上生长的菌

小至大于10mm菌落。

长的菌落大小有时不

落大小有时不一致。

一致。

菌

外观

形态

多样，小而突起或大

而扁平。

多为圆形，有的蔓延生

长为无定形。

培养基表面生长者多

为圆形，内层生长者为

圆形、铁饼、纺锤或三

角形。

色泽

白、灰白或无色，亦小菌落灰白，大菌落形 乳白或粉红色多见，在

落

有淡褐、淡黄及红

成孢子后颜色多样。菌

同一平板上色调较单

色，菌落正反面颜色

落正反面颜色不同。

一。

相同。

透 明

透明或不透明

小菌落半透明有明显

透明较差

度

折光性，大菌落不透

明。

边缘

整齐或不整齐，有放

菌丝体构成，多呈放射

整齐、低倍下可见球

射线状、树枝状、锯

状。

状，卵圆状或假菌丝

齿状、卷发状。低倍

状，细胞细密排列。

镜下一般见不到边

缘。

气味

一般有臭味

往往有霉味

多带酒香味

与 培

不结合

结合较牢固，不易挑

不结合，易挑起

养 基

结合

起。

生 长

一般很快

较慢

较快

速度

形态

球或杆状，细小均

菌丝体相互交织，成熟

多数为圆或卵圆形，常

细

一，高倍镜下可观察

霉菌常有产孢组织及

有芽体相连

胞

形态。

孢子。

排列

单个、分散或有一定

丝状交织

单个分散。

的排列方式。

二 控制菌检查

方法的验证

在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证时，按各供试品微生物限度项下的规定（给药途径）选择相应的菌株，并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。

仪器、设备及用具 见各控制菌检查项下。

试液、指示液 见各控制菌检查项下。

培养基 见各控制菌检查项下。

验证用菌株及菌液制备

菌种

大肠埃希菌（Escherichiacoli）﹙CMCC(B)44102﹚。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）﹙CMCC(B)26003﹚。乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi－B）

﹙CMCC(B)50094﹚。

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）﹙CMCC(B)10104﹚。生孢梭菌（Ciostridiumsporogenes）﹙CMCC(B)64941﹚。

菌液制备 分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙

门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基内，置36℃±1℃培养18～24h，取均匀培养物1ml用0.9﹪无菌氧化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照实验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24h小时，用0.9﹪无菌氧化钠溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。

供试液的制备「见细菌、霉菌和酵母菌计数7」。

验证方法

试验组 取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。验证大肠菌群检查法时，应采取大肠埃希菌作为试验菌。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接种到增菌培养基中。

阴性对照组设立阴性菌对照组时为可验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌：验证铜绿单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。

结果判定阴性对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法作该供试品的控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应参照细菌、霉菌和酵母菌计数

7.8具抑菌活性的供试品项下操作，以消除供试品的抑菌活性。建立新的方法，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。

（一）大肠埃希菌

简述

大肠埃希菌(Escherichiacoli)即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，

随粪便排除体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。

用4-甲基伞性酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β

-D-glucuronide,MUG）和靛基质（lndole）试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白

胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、lndole试验为阳性或阴性即可报告结果。

原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明，96℅的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β

-glucuronidese,GUD）,约10℅的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6℅，鉴于98℅的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与lndole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法力论上可使大肠埃希菌的检出率

达98℅。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。

仪器、设备及用具

无菌室［参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.1.1］。

净化工作台。

2.3培养箱（36℃±1℃）。

2.4高压蒸汽灭菌器。2.5显微镜（1500×）。

2.6微波炉。

2.7恒温水浴（45℃±1℃）。

2.8离心机（500～4000r/min）。

2.90.45µm±0.02µm薄膜及过滤器。

电冰箱。

均浆仪。

366nm紫外灯。

玻璃器皿、器具［参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2］。3试液、指示液

0.9℅无菌氧化钠溶液［附录3.1］。

pH7.0无菌氧化钠-蛋白胨缓冲液［附录3.2］。

pH7.2无菌磷酸盐缓冲溶液［附录3.5］。

无菌对氨基苯甲酸溶液［附录2.2］。

无菌聚ft梨酯80氧化钠溶液［附录3.4］。

靛基质（Wovacs）试液［附录2.17］。

甲基红试液［附录4.2］。

3.8V-P试液［附录2.11，2.13］。

3.9革兰染色液［附录2.4，2.10，2.16］。

中性红指示液［附录4.1］。

亚甲蓝指示液［附录4.3］。

溴麝香草酚蓝指示液［附录4.6］。

酸性品红指示液［附录4.7］。

曙红钠指示液［附录4.9］。4培养基［附录5.1］。

营养肉汤［附录5.1］。

营养琼脂［附录5.2］。

胆盐乳糖（BL）培养基［附录5.6］。

4-甲基伞形酮葡萄苷酸蛋白胨培养基［附录5.7］。

乳糖培养基、5℅乳糖培养基［附录5.21，5.22］。

蛋白胨水培养基［附录5.18］。

磷酸盐葡萄糖胨水培养基［附录5.19］。

枸橼酸盐培养基［附录5.20］。

曙红亚甲蓝（EMB）琼脂［附录5.8］。

麦糠凯琼脂［附录5.9］。

对照用菌液（大肠埃希菌，同二控制菌检查5.2）。

准备

供试品的检验量［见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3］。

供试液的制备。

液体供试品［见细菌、霉菌和酵母菌计数7.1］。

固体、半固体或黏稠液供试品［见细菌、霉菌和酵母菌计数7.2］。

非水溶性供试品［见细菌、霉菌和酵母菌计数7.3］。

含抑菌成分供试品供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时，表明供试品有抑菌活性。该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。

稀释法取规定量的供试液接种到较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑制菌作用的浓度。

离心沉淀集菌法取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，3000r/min离心30min,移去上清液，留底部集菌液约2ml，并稀释该供试液至原规定量。如有不溶性药渣，可先以500r/min离心5min，

取全部上层液，再按上述方法集菌处理。

薄膜过滤法取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约 47mm、孔径不大于0.45µm±

0.02µm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。

中和法取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液

（含1℅对氨基苯甲酸约1～5ml）中；含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚ft梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中（表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）。

沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌之极。

操作步骤

检验程序

阳性对照试验各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照实验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的各控制菌检查。阳性对照试验应出相应的控制菌。已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。

阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。

增菌培养取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml。

1份加入10ml供试液（相当于供试品1g、1ml、10c㎡）另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18～24小时，必要时可延至48小时。阴性对照应无菌生长。

取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。

分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线于EMB或麦糠凯琼脂平板上，培养18～24。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态

特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。

表1 大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

曙红亚甲蓝琼脂

麦康凯琼脂

菌落形态

呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽

鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，

边缘整齐，表面光滑，湿润

当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。

为了规范操作，以下是对药典要求的补充。

纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征

相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养

18～24h，作以下检查。

革兰染色、镜检

以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次（载玻片不烫手）固定。

滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。

滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。

滴加95℅乙醇，脱色20～30s，水洗。

滴加沙黄染色，复染1min，等干后，镜检。

染色结果

革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。

大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。

注意事项

玻片必须洁净，无划痕。涂片的菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。不利菌细胞染色反应判断及形态观察。

培养物菌龄以16～24h为宜。培养时间过长，革兰阳性菌易染成红色。

脱色疑是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。

可用已知革兰染色为阳性、阴性的菌种做染色的质量控制。

生化试验

乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h,观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。

为避免迟缓发酵糖产生假阴性，亦可接种5℅乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。

靛基质试验（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48h，沿管壁加入靛基质试试液数滴，轻轻摇动

试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98℅的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24h即可出现阳性结果。常以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h,作靛基质试验。

甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

乙酰甲基甲醇生成试验（V－P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40℅氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色判为阳性，无红色反应为阴性。

枸橼酸盐利用试验（C）取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。

结果判定

当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告lg或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告lg或1ml供试品

未检出大肠埃希菌。

MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为－＋――革兰阴性杆菌，报告lg或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为＋＋――、革兰阴性杆菌，报告lg或1ml供试品检出大肠埃希菌。

供试品培养物检查不符合9.2中的任一项，报告lg或1ml供试品未检出大肠埃希菌。

当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。

注意事项

MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株：以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出亦判为不合格。

配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光;分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。

培养时间 供试品培养液接种于MUG培养基中，一般培养5h和24h要观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断

时，可延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH值的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。

结果观察取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强的蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管。

药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响。在曙

红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选2～3个以上菌落分别做

IMViC试验鉴别，挑选菌落越多，检出阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别，则易漏检。

在IMViC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。

枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，

发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养2天是不够的，故试验培养时间改为2～4天。

以IMViC试验来判断大肠埃希菌属中的大肠埃希菌是含混的，有可能把埃希菌属的其他种判为大肠埃希菌。IMViC试验为

＋＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌（E.coliinactiue）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫尔曼埃希菌

（E.hermanii）。IMViC试验为－＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌（E.coliinactiue）、伤口埃希菌

（E.vulneris）、蟑螂埃希菌（E.blattae）.

在各类供试品中检测大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复检。检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留1个月，备查。

生化试验也可采用商品化的自动分析仪器进行、仪器可以给出菌种的鉴定结果，做相应报告。

（二）大肠菌群

简述 大肠菌群（Coliform）是指37℃生长时能发酵乳糖，在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌符。合上述定义的细菌除大肠埃希菌属(Escherichia)外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属

（Enterobacter）、枸橼酸菌属（Citrobacter）、克雷伯菌属

（Wlebsiella）等菌属的菌种。大肠菌群包括了正常人畜肠道内的全

部需氧的革兰阴性杆菌以。大肠菌群作为卫生指示菌比大肠埃希菌具有广泛的卫生学意义。因此国，际上以大肠菌群作为药品食、、饮水等的卫生指示菌，对卫生质量的要求更严格。

大肠菌群的检查通过增菌、分离、革兰染色、镜检和确证实验等步骤。

仪器、设备及用具(见大肠埃希菌)。

试液、指示液(见大肠埃希菌)。

培养基

胆盐乳糖发酵培养基〔附录5.32〕。

乳糖培养基〔附录5.33〕。

曙红亚甲蓝(EMB)琼脂〔附录5.8〕。

麦康凯琼脂〔附录5.9〕。

对照用菌液(大肠埃希菌,同控制菌方法验证5.2)。

操作步骤

操作程序

供试品→供试液→胆盐乳糖发酵培养3基6℃±1℃↗18～24h产酸产气→EMB或MaCI平板36℃±1℃↗18～24h乳糖发酵培养基36℃

±1℃↗18～24h产酸产气→报告

增菌培养取不少于10ml胆盐乳糖发酵培养基管3支，加入1：10供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)；1：100稀释的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)和1：1000稀释的供试液1ml(含供试品0.001

g或0.001ml)。取1支胆盐乳糖发酵培养基10ml管,加入稀释剂1ml作为阴性对照。均培养18～24小时，观察结果。

加供试液的胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但产酸产气，则判该管未检出大肠菌群。若胆盐乳糖发酵管产酸产气应，进一步分离培养。

分离培养将上述产酸产气的发酵管中的培养物分，别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板培上养，18～24小时。

大肠菌群的菌落在曙红亚甲蓝琼脂培养基平板上呈紫黑、紫红、曙红或粉红色，圆形，扁平或凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润；在麦康凯琼脂培养基的平板上呈鲜桃红色圆，形，扁平，边缘整齐表面

光滑，湿润。若平板上无菌落生长，或生长的菌落于上述菌落特不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌判，该管未检出大肠菌群；若平板上生长有上述菌落形态特征或疑似菌落且，为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。

确证试验从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。

结果判断根据大肠菌群的检出管数，按表2报告lg或1ml供

试品中的大肠菌群数。

表2 大肠菌群MPN（MostProbablenumbe）r表

各供试品量的检出结果

最可能的大肠菌群数N

﹢

﹢

﹢

＞103

﹢

﹢

﹣

102＜N＜103

﹢

﹣

﹣

10＜N＜102

﹣

注:

﹣

+检出大肠菌群。-未检出大肠菌

﹣

＜10

0.1g或0.1ml

0.01或g0.01ml

0.001或g0.001mg

（个∕g或ml）

注意事项

加供试液的胆盐乳糖发酵管由，于有的药渣颜色较深或沉淀物较多，干扰结果的观察。应仔细观察倒管底部或试管壁培、养液表面有无气泡。针尖大的气泡也是产气。

胆盐乳糖发酵培养基内的倒管不小于30㎜×3㎜(内径)。否则，倒管被药渣遮挡不便观察结果。

加供试液胆盐乳糖发酵管，经培养后，其倒管内无论产气多少，均应做分离培养，革兰染色、镜检。如产气太少，可延长培养时间。

尽可能多挑选曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基平板上大肠菌群的可疑菌落，做乳糖发酵确证实验。挑可疑菌落越多，可提高大肠菌群检出率。

（三）沙门菌检查法

简述

沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，按Bergey系统细菌学手册第一卷（1984），沙门菌分5个亚属。2003年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌种即肠炎沙门菌和乍得沙门菌，其中肠炎沙门菌分6个亚种，包括常见的伤寒、甲型

副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌在内，迄今已发现2501个血

清型。O抗原血清的A-E群包含了沙门菌分离株的95%，所以常见沙门菌A-FO多价血清进行沙门菌初筛试验。药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每10g（10ml）药品中是否检出沙门菌作出检验报告。

由于沙门菌血清型繁多，各血清型的生化及血清学特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件。

此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。

仪器、设备及用具（见大肠埃希菌2）

试液指示液（参见大肠埃希菌3）

无菌脲试液[附录2.5]

酚磺酞指示液[附录4.4]

亮绿试液[附录2.9]

氰化甲试液[附录2.14]

溴甲酚紫指示液[附录4.5]

3.6革兰染色液[附录2.4，2.10，2.16]

3.7沙门菌属A～F“0”多价血清（0多价1）生物制品研究所供应

培养基

培养琼脂培养基[附录5.2]

营养肉汤培养基[附录5.1]

半固体营养琼脂培养基[附录5.3]

曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）[附录5.8]

麦康凯琼脂培养基[MacC][附录5.9]

四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)[附录5.11]

三糖铁琼脂培养基(TSI)[附录5.10]

胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)[附录5.13]

沙门菌属志贺菌属琼脂培养基(SS)[附录5.12]

蛋白胨水培养基[附录5.18]

脲(尿素)琼脂培养基[附录5.23]

氰化钾培养基[附录5.24]

赖氨酸脱羧酶培养基[附录5.25]5对照用菌液

取乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液释至1：106（50～100cfu/0.1ml），作阳性对照用菌液。其菌液浓度可用平板菌落计数法测得。即取

0.1ml加入平皿内，倾注营养琼脂，混匀，或以0.1ml均匀涂布于事先准备好的营养琼脂平板上，经培养后点计求得。

操作方法

准备工作：[见细菌、霉菌和酵母菌计数6]

供试液的制备：[见细菌、霉菌和酵母菌计数7]含抑菌成分供试品供试液的制备：（见大肠埃希菌6.2）

阳性对照实验、阴性对照实验（见大肠埃希菌7.1）

增菌培养

预增菌取营养肉汤培养基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供试品使匀，另1份加入稀释剂10ml作阴性对，36±1℃培养18～24h，观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。

增菌培养轻微摇动供试品增菌培养瓶，吸取1ml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24h。

分离培养轻微摇动供试品增菌培养瓶，以接种环分别沾取1～2环培养液接种于胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门菌志贺菌琼脂

（S.S）平板及曙红亚甲蓝（EMB）琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h，必要时延长40～48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。

沙门菌在上述平板上的菌落形态特征见表1

表1 沙门菌的菌落特征

平

板

胆盐硫乳琼脂（DHL）

沙门菌属志贺菌属琼脂

（S.S）

曙红亚甲蓝琼脂（EMB）

麦康凯琼脂（MacC）

菌落形态

无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色

无色至淡红粉色，透明或半透明，菌落中心有时带黑褐色

无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落

无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时

带暗色

由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般

为无色半透明，多数沙门菌因产生H

S，菌落中心呈现黑色甚至

2

全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显。在SS琼脂平板上，HS特

2

征有时不明显，沙门菌属III因多数菌株发酵乳糖，故在上述平

板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H

S，在有HS

2 2

指示系统的平板上仍出现黑色中心。在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别。由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别。

初步鉴别试验

从每个供试品的分离平板上挑取2～3个疑似菌落（菌落形态特征与表1所列的形态特征相符或疑似）分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培

养物划线于三糖铁琼脂斜面并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养18±24h，观察结果。

疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：①斜面红色（产

碱），底层黑色（产H

S）并显示黄色（产酸）；②斜面红色，底

2

层黄色；③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。

将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清学凝集试验及革兰染色，镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。

生化试验

靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养

基中，照大肠埃希菌靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。

脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种脲琼脂斜面，培养24h，观察结果。斜面变为红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应。

氰化钾试验 将培养物先接种至营养肉汤培养基中，培养20～24h，用接种环沾取培养液1环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24～48h，观察结果。对照管内有菌

生长（混浊），而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（混浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。

本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。

氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基，每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml去毒。然后再灭菌、洗涤。

赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24～48h观察结果。对照管黄色（产酸），试验管呈紫色为阳性反应（赖氨酸脱羧产碱）；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。

动力试验 用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长，使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留2～3天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动。动力学试验阳性。

沙门菌生化反应的初步鉴别见表2。

表2沙门菌与有关细菌在三糖铁琼脂及初步生化试验的鉴别

1.2

+／-

+

+

+

-

-

-

+

沙门菌属Ⅲ

2

-

+

+／-

+

+

-

-

+

缓慢爱德华菌属

3

+／-

+

+／-

+／-

-／

+

-／+

+／-

-

弗劳地柠檬酸杆

菌

4.1

-

+

+s

+

-

+

+

-

奇异变形杆菌

4.2

-

+

+ ／

-s

+

+

+

+

-

普通变形杆菌

5

+／-

+

+／-

-

+／

-

-

-

+／-

大肠埃希菌

6

-

+

-

-

-／

+

-

-

-

志贺菌属

7.1

+

+

+

-

-

+／-

+

-

阴沟肠杆菌

7.2

+

+

+

-

-

+／-

+

+

肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌

8

-

+

+s／

-

-

+

+／-

+

-

普罗菲登斯菌

属、摩根菌属

序

号

三糖铁琼脂

靛基质

脲酶

氰脱赖羧化

钾

氨

酸酶

斜

面

-

底

层

+

产

气

+／-

硫

氢

化

判定菌属

1.1

+／-

-

-

-

+

沙门菌属

9

-

+

+／-

-

-

-／+

+

+

蜂房哈夫尼亚

菌、粘质沙雷菌

注：+产酸（黄色），阳性，阳性率>90%；-产碱（红色），阴性，

阴性率>90%；+/-多数阳性、少数阴性、+S产生少量气体（本表依据

何晓青卫生防疫细菌检查检验参考第八版美国临床微生物手

册）；反应序号1.1不产H

S，可结合血清学凝集试验，或加做部

2

分生化试验；判定为沙门菌；反应序号1除典型反应外，脲酶、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验三项中有一项异常；反应序号2仅靛基质阳性。其他情况可排除沙门菌。

血清学凝集试验

准备1片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm接种环沾取沙门菌属O多价1血清2～3环制成与玻片横径相垂直的条形涂沫，长约1.5cm，宽约0.5cm。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。

用接种环挑选取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂面的新鲜培养物少许，在血清中和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。

将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min，再观察结果。如果仍然没有出现凝集现象时，应取面培养物，置于含少量0.9%无菌氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷，在做凝集试验，如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应。

如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养

物进行处理再作凝集试验。

结果判断

供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应。多价1血清凝集试验阳性反应（含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阳性反应），报告10g或10ml供试品检出沙门菌。

供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应。多价1血清凝集试验为阴性反应（含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阴性反应），报告10g或10ml供试品未检出沙门菌。

供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种，送交有关单位鉴定后，再作报告。

供试品培养物生化反应应符合沙门菌属反应多价1血清凝集试验阴性反应。

供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应多价1血清凝集反应呈阳性反应。

对已检出沙门菌的供试品分离菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。根据检出菌的特性，推断可能菌型，增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“O”及“H”进行鉴定。

注意事项

试验用培养基，需经过质量鉴定，用已知典型反应菌株（如乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]）进行测试，其灵敏度及特征

性反应应符合要求。培养基需在规定条件保存，在规定时间内使用。分离平板在使用前应置36℃温箱内倒置孵育1～2h，使其表面温暖湿润，利于分离。

在对供试品进行测试的同时，需作阳性菌对照及阴性对照。阴性对照应无菌生长，阳性对照应显示阳性结果，否则检验结果无效。特别是用接种环沾取菌液进行接种或分离时，避免动作过大，形成气溶胶，污染操作环境。

为保证试验方法的可靠性，对分离平板上的疑似菌落，应多选取几个菌落同时进行试验。挑取菌落时，不要在分离平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而应在菌落分布稀疏部位挑选。

生化试验及血清学试验的被鉴定培养物必须是纯培养物，否则，不可能得到正确结果。如遇血清学凝集试验阳性时而生化试验不符合，应首先检查培养物的纯度。对已污染的培养物，不应丢弃，因为污染菌可能掩盖沙门菌，故应对被污染的培养物重新分离，仔细选取单个菌落再进行试验。

所有生化反应均需按照规定的实验要求进行，如观察三糖铁琼脂斜面反应的时间，应在24±2h，时间过长过短，都可能出现错误结果判断。又如氰化钾试验，试管口应密塞，否则氰化钾浓度降低，致使抑菌作用下降。

血清凝集试验的影响因素甚多，除与电解质、pH、温度有关外，须特别注意抗原与抗体用量的比例恰当，只有当二者浓度适

当时，凝集反应方明显可见。由于本法试验用多价血清，其凝集力相对较弱，试验用菌液量切不能过大。测试前，应用已知阳性菌测试以掌握适宜菌液浓度。

沙门菌为肠道重要致病菌，操作时应特别注意防止分离待检菌及阳性对照菌对操作环境及试验的污染。所有用过的增菌、分离、生化试验培养基、血清学凝集试验及染色镜检后的玻片等，均需经灭菌后方能洗涤。

（四）铜绿假单胞菌

简述

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginos）a习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌。广泛分布在土壤、水及空气，任何动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品本。

菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤，眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的

耐药性，增加了治疗的难度，国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一。

铜绿假单