浙大考研生物化学课件基因工程

实验要求上课时间与纪律:8:40-16:40实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意走动课前预习、课中认真操作、课后的实验报告妥善保管好每组的实验器具。实验操作要求人人动手。值日制度每一组实验器具微量移液器（lmk200微升、20微升）枪盒（三类）装有小离心管的饭盒、镣子离心管架冰盒浮漂旋涡振荡器使用对应的吸头（枪头）、确认样品的加入。公用仪器离心机旋涡振荡器恒温水浴培养箱冰箱电泳装置低温高速离心机水浴锅Gaiam微波炉摇床Gaiam微波炉摇床1

紫外透射仪PC%超净台超净台《基因工程实验》课程建设.编写一本实用性较强的实验讲义。.建立一个切实可行的基因克隆的实验体系。.精心制作了PPT实验教学多媒体。1、讲义内容基因文库的构建靶基因的获得载体质粒的制备扩增质粒的构建表达质粒的构建与诱导表达工程菌的培养与目标产物分离2、实验体系细菌染マ体的提取获取目的基因(引物设计、PCR扩增)

构建扩增质粒(鹹切!连接、转化、筛选)

构建表达质粒(爾切、3接、转化、筛选、鉴定)目的基因的诱导表达,基因产物分离、纯化以几丁成的的基因克隆为主线的连续系列实验,毎ー个实验紧密衔接.基因工程(Geneticengineering)综合采用了生物化学、遗传学和微生物学等的现代技术,在体外试管内对大分子DNA进行剪切加工,再与不同亲本DNA分子重新组合(recombination),并把它引入受体细胞中去,通过复制(replication)、转录(transcription)、翻译(translation)以及表达(expression),使生物获得新的遗传性状。3、实验教学多媒体•在丁鸣老师、邵爱萍老师、周红军老师等共同协作下,跟踪拍摄了实验全过程,精心制作完成了《基因工程实验》多媒体,为老师的上课以及学生对课程的理解提供了方便。•在此对给予我们大力支持的各位老师表示深深的谢意!实验计划表培养マ角实验说イ 培养转化子:细菌染色体DNA提取凝胶电泳确认 pBSKST)H5a pET28c(+>DH5a核酸含最与纯度测定 pBSKS(hi.VDII5a第二日——レ4 i PCR扩增反应 质粒提取pBSKS、质粒梶取:pET28c(十)凝胶电泳确认 质粒的电泳 及pBSKS*ChiAPCR产物的提纯质粒电电泳iECRだ物与pBSKS的幽切过夜 pBSKS-ChiA及pET28c(+啲歯切pBSKヌー中,泳 pl打:!':c.6电泳第四日 k i PCR产物电泳、割胶 pBSKSQiiA电泳、割胶PGR®也及pBSKS的切纯化 cluAftf切及pET28c的切纯化・PCR与pBSKS的连接 ChiA与pET28a+)的连接第五日ーDH10B与BL2】培第五日ー感受态细胞的制备倒平板(LB，Amp,LB/Kan)转化(DH10B)涂平板(LB/Amp)转化(DH10B)涂平板(LB/Amp)培养涂平板(LB/Kaii)培养...-I^TG+X-gal挑选菌落(抗生物抗性、蓝白筛选)CLB/Kai)SouthernbloUuig(电泳、凝胶处埋转膜过夜)条色体DNA挑选菌落(抗生物抗性、蓝白筛选)CLB/Kai)SouthernbloUuig(电泳、凝胶处埋转膜过夜)菌株的培养(LBzAmp)ssj-p I j 梶取质粒(重组ス部分样品保留提取质粒的电泳质粒囲切及电泳确认重组子▼際的タ烘，作理F■pBSKSC'hiApETChiApETChiA/BI/H培养第八日 ー丄 Z\fcj T 诱导寰达探针标记电泳样品的制各 杂交酸酸铉沉淀第九日 | 制胶(SDS) 洗膜、显色SD&PAGE电泳、奥色、脱色第十日一总结、实验报告上交、考试预期的实验结果1）染色体DNA提取PCR产物3）质粒提取4）质粒的繭切5）割胶、提纯6）感受态细胞、转化（效率）7）蓝白斑筛选8）扩增、表达质粒提取及駒切情况9）southernblotting10）基因的表达实验考核・平时的实验操作40分•公共实验参与10分•实验结果10分・实验报告・25分•考试15分1、基因组DNA的制备•本实验系列多媒体是在丁鸣老师、邵爱萍

老师、周红军老师的大力协作下完成的,

对他们的辛勤付出表示深深的谢意!实验目的:制备高质量的基因组DNA作为PCR扩增的模板以及用做southernblotting分析。实验原理:（P15）提DNA:细胞裂解、RNA与蛋白质的降解与去除、酒精沉淀DNA。防止DNA降解:机械、蛋白酶、化学（酸）实验操作|I,取1.5ml的培养液,12000rpm离心2分钟。.沉淀添加560111的TE,充分悬浮。.加入30111的10%SDS和6可的lOmgml的蛋白酶K,混匀,于37c保温1小时。.加入100111的5moi/LNaCl,充分混匀。.加80WCTAB/NaCl液,混匀,在65c条件下保温10min〇.加入フ50n氯仿/异戊醇,混匀,12000rpm离心5min〇.取上清加入750贝苯酚/氯仿/异戊醇,混匀,室温12000rpm离心5min<.取上清加入450g异丙酥,轻轻混匀直到DNA沉淀下来（室温lOmin），4"C、8000rpm离心10min,弃取上清・.用1ml70%酒精洗涤,4C、12000rpm离心5min。.弃去上清液,沉淀在室温条件下倒置干燥10/5min用100川的TE缓冲液溶解DNA。.加2u1的lOmgmIRNascA酶,37c水浴20min除去RNAo.取5ul样品进行电泳,样品贮存在4ヒ冰箱中。2、DNA的电泳1、实验目的:（p41）学习与掌握进行DNA电泳的方法,利用电泳检测DNA纯度、含量以及分子量,还可以分离不同大小DNA片段。2、实验原理・:电泳概念及种类影响电泳迁移的因素影响电泳迁移的主要因素DNA的大小DNA的构象・琼脂糖浓度・缓冲液

分而不同大小DNA片段的

合适琼脂糖凝胶浓度琼脂糖含(%)DNA片段的有效分离范围(kb)0.35-600.51-300.61-200.708-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3缓冲液TAE：乙酸盐缓冲液TBE：硼酸盐缓冲液TPE：磷酸盐缓冲液实验操作■.称取0.7克的agarose琼脂糖,加入100ml0.5XTBE,在微波炉上加热,使琼脂糖熔化。.等凝胶温度降至大约55c以下时,加入5"的0.5mg/L漢化乙锭(EB)«.将移胶板放入胶室中,并将梳子垂直安插在移胶板上方,将凝胶倒入胶室中。.等凝胶完全凝固后(约30分钟),将梳子轻轻拔出..将凝胶体放入加有0.5XTBE电泳缓冲液的电泳槽中,并且使电泳缓冲液髙出凝胶。

.取2m6X上样缓冲液与5jdPCR产物混匀后,加到凝胶孔中,.加入如3Ji1的marker..盖好电泳槽盖子.选择适当的电泳电压(100V)以及电泳方向,开始电泳。.前面色素接近胶的先端,切断电流,停止电泳,打开槽盖・.取出样品,在紫外灯下观察,摄像.DNA标准分子量 入DNA//7z>7dIIIMarker23.1kb2.3•0.562.0•0.563ヽPCR扩增目的基因1、实验目的:（p39）利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因以及Southern杂交的探针2、实验原理・:模板、引物、底物在体外进行DNA的扩增预变性(92-95エ2-PCR的般过程:变性(92-95工30,)(25-35)复性延伸总延伸变性(92-95工30,)(25-35)复性延伸总延伸«0-«0,C,30»)(72ヒ30划，) (72«C,7m)经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上.样品DNA预变性双链DNA解链,94*C5min引物与单链模板DNA结合

30-60X：,30秒ー1min双链DNA解链双链DNA解链94C、0.5-1min聚合酶合成新链65-75*0.2-5min延伸反应完成•引物设计FP,RP(forwardprimer,reverseprimer)SP.AP(senseprimer,antisenseprimer)•循环参数:①变性(denaturation)②退火(annealing)③延伸(extension)④循环次数(cycle)引物几丁质酶基因的两端序列为:5'-CAGTTATGCGCAAATTTAATAAA AGCGCCGGCGTTCAATAATCG-3'上游引物:5,-GCGGATCCCAGTTATGCGCAAATT-3,(BamHI) 24baseGC=50%下游引物:5'-GCGAA(rCTTGATIATTGAACGCCGG-3'(，加dill) 25baseGC=50.5%

PCRが懵伍1■■■■2BBSss反应体系PCRが懵伍1■■■■2BBSssddl1,0模版DNA上游引物(l()Nmol/L)下游引物(而mol/L)dNTPmixture(1Ommol/L)10倍X缓冲液+MgCl,Taq甑72.5pl5pl(100-200ng)*15pl72.5pl5pl(100-200ng)*15pl5pl3pl(各20nmol)10pl0.5pl(2.5U)实验操作dNTPmixture(1dNTPmixture(1Ommol/L)10倍 ICI2Taq的10|il0.5|il(2.5U)总体枳1001111.取ー个0.2mleppendorf管.ddH2O模板DNA上游引物(10|imol/L)下游引物(10|imol/L)添加以下各种成分反应液72.5卩15ul(10<)-200ng)*15ul5|ilI3|il(各2Qnmol).稍作惠心.将反应管放入PCR仪中..设定反应程序: ■94c条件下使模板DNA预变反5min。变性 94c Imin退火 55c Itnin| 30cycles延伸 72c 2.5miノ最后在フ2c条件进行延伸7-10min。c保温4.取5|11反应液用0.7%琼脂融凝胶进行电泳,鉴定PCR产物是否存在以及大小。4、PCR产物的纯化实验操作(p43).电泳确认后将PCR产物移至1.5ml新的cppcndorflf中。.加入200WTエ缓冲液,加入300m酚/氯仿/异戊醇,混匀,室温,12000rpm离心5分钟。・.取上层水液添加1/10体积(约30可)的3moi/L的NaAc(pH5.2)和2.5倍体积(约O.75mD的冰冷无水乙醇。.-20C冰箱中放置30min以上。.4cヽ12000rpm离心5min。.弃上清,添加1ml的冰冷70%乙醇。4C、12000rpm离心5min。.弃去上清,室温干燥,30WTE液溶解沉淀。5、质粒的提取1、实验目的:（p61） ■学习与掌握最常用的质粒DNA的提取方法2、实验原理・:碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。

ImHIIT74“91“JIfcoO109l(DrillXho\Si/l/M/mllMalfi1106l(C/il)KimiIIIFcoRVfMRIP$tlSiriI命何HI$”1x”iNonF“l$"H83fxiStcl8KHlIpET28c(+)8KHlIT7promottrprwiar»6«348lモ钱「i Jx―z ヽAU：CKC*TCCCGCGJUATTMTACGKTCKT*TAGCCUArrGTCA«CUaTUCMnCCCCTCTAGJUATAlTTTTGnTUCTTTMuIuIcA,皿 IT.. J^tLy».LTMIj-TATACCA!CCWACCAac7Tutc7rUTc7u7cAGCACCCCCCTttTCCCaWGGCAGCCA：AT；Q；-AC；A!UCTGGrC4KACCAa"•iCtyUfUrW.yiitMuH.tM.sx.tSefStrCiyLtvio^roAr^CtySerM.pietAiaSe/RttThrCtyCiwCiftfiin—&5??区5B!エし"I儡加］“T1ATCWrCGCttAfCCUarTCGAKTCCCTCCKAAttTT^GGCCKACTCtAaA：CACCACCACC«CACTGAU!CCCaTKr<iCUACCCCPCT・如E"*'*•"，华bp，GIMMGlwl«uA，y，9GlAJUeC.tClyArgrhrAr8i“rMrMrM，“，ot♦uA/954rGiyCytCMMTCCCUrtCCAATTCUCCTCCCTCCKuanCCttCCGC.ACTCCAaiCCACCMCACCACCACTCAUrCttCCTCCTAMAAACCCC乂わ4(・)5”r $<ハ。IAREH«A101qlZIw，・・"t*，*，*，メ府UteiXlfctUATTCUCCTCC6T(UCAACCTrGCGGCCaMTCGAaACCACCKCACCACCKT6AUTCCCCCTGCTAACAMGCcFp€T-2^(H••“udlSM,elIMr81"，加 メrw•-$•，S«rThrThrThrThrTl«rthrCiu|।•“dMauThrtWe41181 T7MnalorUMCCOiCGACTrttCTCCTCCCKCGCTGAGCAATAKrAaAJAMCCCTTGCCaCTCTAAACGCSKTTGAUCGTTTTTTCT7Miwutorprw«r«6833M实验操作.取1.5ml培养液在4C、12000rpm离心2min,奔去上清液,收集菌体..加入loom的溶液I,使菌体充分悬浮,室温条件下静置5min。.加入200可新配置的溶液11.温和上下颠倒2-3回,冰浴条件下静置5min。.加入150川的溶液山,上下颠倒混匀数次,冰浴条件下瀕置5min。.4c条件下12000rpm离心lOmin。.取上清,加入等体积（400ul）的酚/氯仿/异戊醇,充分混匀,室温条件下12000rpm离心5min。.吸取上层水相,加入1/10体积量（约40jd）3moLL的pH5.2NaAc,再加入2.5倍体积（约1ml）的预冷的无水・乙醇。8,放入ー20c冰箱中静止30min•然后在4c条件下12000rpm离心15min。.弃去上清液,加入1ml预冷的70%乙醇,在4c条件下12000rpm离心5min,洗涤沉淀».弃上清液,沉淀物自然干燥后,加入40WTE缓冲液溶解沉淀（pET质粒用25TE溶解）。.加入2m的lOmg/ml的RNaseA繭,37c保温20-30min..取5m的质粒电泳・6、酶切反应1、实验目的:（p70）将目的基因与我体DNA用适当的限制性内切甜进行处理,用于DNA的体外重组。2、实验原理・:•限制性内切酶:命名与写法•缓冲液限制性内切酶Hpai

5,Hpai

5,圆理］囚囚四3,

丁©©画斑忡，

CUTEcoRI5恒^)000©?3'©0①囚回回5,HindW

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CUTPsAEnzymeRttognitionSequence*1MicroorganitmAlulAG|C*TArthnobatterhuesBamHIGJGATbCBacillusamyMiqucfattmiHGCCNNNNN|NGGCBacillusglobtguHniA|GATCTBacillutglobtgnEcoRIGjAATTCEitheruhiataliRY13EcoRIIJCU《，GGfwhrruhiocoilR24S“RVGAeT^ATC上“*Edto J62IHG74HurllRGCGC|YHarmophtluiacgyptiuiflarlllGG|C*CHatmophtlutacgyptiuiHlndlllA,|AGCTTilafmaphiluitnftuenzae%HfallC|C*GGHacmaphtluiparainflumzacMsplCe|CGGMoraxtllaspeciesPulCTGCA,1GProvidrnclouuartllIMPvtdlCAGJUTGPrvicutvul^artsSallG^TCGACSlfvptomycciafbuiGToqlT，CGA・Thrrmuiaquaticu%XholQTCGAGXanthomanathokiccla*Thcrccojcnitionsequencei»abbrrvtatedm>thatonlyone'trend,rexiinf5*toJ*,togivenThecleavage»ite1»reprv»cnte<ibyanarrow(J)andthemodifiedbase,wherettteknown.“indicatedbyanastemk(A*toN*-methylad<nineandCai»%meihylcyto»ine)R.Y.andNrrpmentapunnenucleotide,apyrimidinenucleotide,andanynucleo<Mlc.respectivelyiScwarrRobert*.RJandMacclis.D..REBASE-therrsincitonenzymedatabax.http/Avwwneb«mVr*ba*rIー种限制除只能识别ー种特定的核甘酸序列,并在特定的切割点上将DNA分子切断.目前已发现的限制前有200多种.

酶切反应（甲）.在0.5mlcppcndorf管中加入下列成分,（定容40H1）A：A：PCR产物ddlkO2WPCR30ul(5jig)10X缓冲液4glHindIII2glBarnHI2mB:质粒DNA：ddIl2O 2|ilpBSSK(0.5*g,曲30gl10X通用缓冲液4mHindIII(lOU/fil)2glBamHI(lOU/gl) 2山.混匀,少许离心一下。.在37ヒ条件下反应24小时以上,或酶切过夜。.取5m醉切B进行凝胶电泳,预检.（乙）1.在eppendor階中加入下列成分（定容40卩1）は:pBSSKChiA：B:质粒DNA：ddlLO2MlddHjO2|11质粒（5四）30/1pET28c(+)(0.5/g/g30pl10X缓冲液4ulrI0X通用缓冲液4卩1HmdIII2MlHindIII(lOU/gl)2mBaniWI2卩1|BaniHI(lOU/gl)2gl.混匀,少许离心一下。.在37c条件下反应2-4小时以上,或酌切过夜。.取5川駒切"进行凝胶电泳,预检。7、电泳、割胶、纯化DNA1、实验目的:（p75） ■将所需要的DNA片段进行回收,纯化。2、实验原理:

MarkerPCR酶切MarkerpBSKSChiA酶切实验操作2.长波长uv照射下,判定DNA位置,用手术刀割下含有要回收DNA,放入1.5ml的离心管中・.按每lOOmg胶加400jdSolutionSN,65c水浴5min,中途混匀,直至胶完全融化。按每100mg胶,加SolutionBlOOge混匀。.将3s柱放入2ml收集管中,融化的胶溶液转移到3s柱中,开盖,室温放置2min。室温10000rpm离心Imin..取下3s柱,倒掉废液,将3s柱放入同一收集管 ・中，加600111WashSolution室温10000rpm痛心Imin〇.重复4.取出3s柱,倒掉收集管中的废液,将3s柱放入同ー个收集管中,室温10000rpm离心2分钟。.将3s柱放入新春心管中,在柱的膜中央加30卩1预热的TE,室温放置2min.10000rpm离心Imin,离心管中液体为回收DNA片段。ー20c保存8、DNA片段的体外连接1、实验目的:（p78） ■将来自不同生物的DNA片段在体外进行连接,以构建新的重组DNA。2、实验原理:连接缓冲液的量实验操作（甲）.在离心管中加入以下样品:TOC\o"1-5"\h\zPCR产物 6ulpBSSK酶切 2.10X连接缓冲液T4DNA连接酶 lul.混匀后,离心将液体全部甩到管底..16ヒ条件下保温过夜。.-20*C备用（乙）1,在髙心管中加入以下样品:TOC\o"1-5"\h\zChiA基因片段 3mpET28c（+）磨切 5m10X连接缓冲液 1贝T4DNA连接酶 lul混匀后,离心将液体全部甩到管底。16c条件下保温过夜。-20ヒ备用9、重组DNA的转化1、实验目的:(p81)CaCL制备感受态细胞,用于重组质粒的转2、实验原理:亲缘关系、菌体的年龄、环境因子(CaCl2ヽcAMP)感受态细胞的制备.接种DH10B于LB培养基中37c振荡培养过夜。.接100W培养液于5ml的LB液体培养基中,37c条件下振荡培养2-2.5小时左右,OD600达0.4。.将1.5ml培养液移至cppcndorf管中、冰浴20min。.4で条件下,4000rpm离心5min,弃去上清液。.添加0.75ml预冷的CaC12溶液，用枪轻轻吹打..冰浴30分钟后,4c条件下,4000rpm离心5min,弃去上清液。.细胞沉淀用100川预冷的CaC12溶液悬浮。.冰浴放置，答用。转化取一管100贝的感受态细胞,加入质粒与目的基因的连接产物5W,轻轻用枪吹打均匀,冰浴20min42C、保温90秒钟,迅速放入冰中,冰浴5min。添加1ml的LB培养基.37c振荡培养1小时.3000rpm离心5分钟,弃去1ml上清,余下0.1ml用枪吹匀,吸至含有抗生素的LB培养基平板上,另添加20/120mgm1X-gal和40贝的100mmol/LIPTG,均匀涂布。37c倒置培养8-12小时。10、阳性克隆的筛选1、实验目的:（p87）学习与掌握阳性克隆的筛选方法,了解抗药性筛选和a-互补蹄选的原理。学习电泳法筛选鉴定重组质粒的方法。2、实验原理・:抗生素兰白筛选 提侦粒高切电泳核酸杂交或PCRGE转化子（不含质粒）非重组子（含空载我体）c载体受损重组子〈 期望重组子（含目的基因）重组子ー非期望重组子a互补筛选法（显色模型筛选法）pBSSKpUC(/acZ,)DH10BJM109(/acZMl5)a互补筛选法（显色模型筛选法）pBSSKpUC(/acZ,)DH10BJM109(/acZMl5)b«ct»n«lcell(JMIO9)ノ\7I厶・レ+人4(丫J■—tt.蓝白筛选实验操作.选取白色单向,接入5ml含抗生素的LB培养基中,37c振荡培养过夜。.取1.5菌液抽提质粒,部分菌液4c保存.质粒抽提后,最后溶解于40jil的TE中。4,质粒电泳构建的扩增质粒（甲）、立ヨ曾、立ヨ曾3L*、质是扩26匕此勺j一Lヌ可标质抽提质粒的酶切鉴定5.对初步确定有外源基因进入的质粒用

限制性内切酶进行切割、鉴定。TOC\o"1-5"\h\z重组质粒DNA 10glddH2O 6H10X通用缓冲液 2MBamHI 0.5gl〃加dlH 0,5^16.37ヒ保温0.5-1小时7I电泳

扩增质粒的酶切（甲）Marker1Marker1、2、5、6是需要的扩增质粒M123 56PCRpBSKS2#扩增质粒的确定（甲）——PCR法

构建的表达质粒（乙）1#2#3#4#MpET28c(+)表达质粒的胸切（乙）M：DNA标准分子量1#表达质粒/菌切2#表达质粒/酶切酶切pET28c（+）酶切PCR产物discofobsortentp«perraOioectivtlylabeledDMAproo«raOioectivtlylabeledDMAproo«INCUBATEWITHPROK

ANOWASH

coloniescontaining

plttmidof

mterettEXPOSSPAP£RTOヽPHOTOGRAPHICFILHPeindiiiivdthcoloniesofbacteriacontainingrecombinantplasmidsOoundtoPEELPAPERFPEELPAPERF師MDISHTOWOWCEREPIICAOFCaONIESIYS£BACTERIAANDD€NAT麻MAWITHALKALI-r

positionofdesired

coloniesdetected与

autondiogrophy、外源基因的诱导表达1、实验目的:(pl()8)学习和掌握外源基因的诱导表达方法,为SDS分析做准备。2、实验原理:实验操作.将含有pET28c重组子的BL21菌落接种于2ml含卡那霉素(SORg/ml)的LB培养基中,37C振荡培养过夜。.分别取150可培养液于5ml含卡那毒素(SOpgml)的LB培养基中,培养2小时左右,至OD600达0.5左右。.取出1.0ml样品作为IPTG诱导前的样品。.其余样品中添加12m的lOOm'lIPTG继续培养。.分别在1、2,3,4、5小时后取出1.0ml样品作为IPTG诱导后的样品。.IPTG诱导前与诱导后的样品12000rpm离心2min。.回收菌体沉淀..菌体沉淀样品中加入30WpH7.4的PBS缓冲液和10皿的4XSDSloadingbuffer,在旋涡混合器上剧烈震荡Imin,使歯体完全溶菌。.将样品在100C沸水浴中保温5min,立即放入冰浴中冷却..12000rpm离心Imin,回收上清1L样品直接进行SDS分析或在ー20c冰箱中保藏。12、SDS、实验目的:（pill）利用SDS电泳检测表达蛋白,确定蛋白质的分子量。并掌握其原理与方法.2、实验原理:（一）电泳胶的准备与电泳制胶板的安装,要求密封,以免胶液泄漏.配置适量（如7.5ml）的10%浓度的分离股TOC\o"1-5"\h\zH2O 4.0ml30%胶母液 2.5ml分离般缓冲液(pl®8)09ml10%SDS 75pl10%APS 60PlTEMED 5pl3,将分离胶加入制胶槽中,注意应髓着边缘缓慢加入,千万别进气泡・凝胶液加至约距前玻璃板顶端15cm或距梳子齿约0.5cm处.4,在分恵胶溶液上覆盖ー层篁蒸水封胶,使凝酸表面变得平整,静放大约30min便凝胶聚合.除去上面的水层,用纸巾吸尽残留的液体•配置5%浓缩胶30%胶毋液 0.5ml浓缩胶缓冲液(pH6.7) 0.37mlTOC\o"1-5"\h\zHK) 21ml10%SDS 25/1IO%APS 253TEMED 5pl迅速将配置好的浓爆胶添加到分离胶上面,并将儘子插入凝胶内,血至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐（小心避免混入气泡）.凝胶聚合后轻轻拔出推子.在上下电泳槽中添加I/电极缓冲液.在电泳槽的泳道中分别添加标准蛋白质与样品.接通电源,起始电流20mA,起始电压80V.电泳大致需要23小时•恃漫酚范前沿到达电泳槽底部时,切断电源,从电极上拔掉电被插头,取出玻璃板・（二）染色与脱色.电泳先后,带上手套,小心从制胶板上将栽胶剥下,弃去浓缩胶.在右下角切去小片作为定位标记..用清水洗胶,將分离股放入集色液中缓慢摇动,染色2CU30分钟..取出用水漂洗后，将胶放入脱色液中进行扩散脱色,11到背景藻色褪淡,见到条带,大约换35次脱色液即可・.确定外源基因表达的蛋白是在上清液中,还是在菌体胞内..电泳迁移率的计算:.计芽样品蛋白质的分子量.13、Southernblotting实验目的(p95).通过Southern杂交,检测重组DNA分子中插入的外源DNA片段是否是原供体菌株中的一个基因片段,同时可以检测基因片段在基因组的不同酶切条件下的分子量大小。.学习与掌握Southern印迹杂交技术。实验原理1.DNAsamplescutwithrestrictionenzymesareloadedonagarosegelforelectrophocesislane1：RadioactivesizemarkersLane2:DNAcutwithrestrictionenzymeAUne3:DNAwithrestrictionenzymeB,GelelectrophoresisDNAisdenaturedGelisplacedonspongewickPapertowelsDNA*b«ndingfilter3.DNA-bindingfilter,papertowelsandweightareplacedongd;buHerpassesupwardthroughspongebycapillaryactiontransferringDNAfragmentstofilter1.DNAsamplescutwithrestrictionenzymesareloadedonagarosegelforelectrophocesislane1：RadioactivesizemarkersLane2:DNAcutwithrestrictionenzymeAUne3:DNAwithrestrictionenzymeB,GelelectrophoresisDNAisdenaturedGelisplacedonspongewickPapertowelsDNA*b«ndingfilter3.DNA-bindingfilter,papertowelsandweightareplacedongd;buHerpassesupwardthroughspongebycapillaryactiontransferringDNAfragmentstofilter2.DNAisseparatedby