仪器分析课件-色谱法引论

1、

色谱法？茨维特的实验茨维特：

植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906

年

的文章中，首次提出了色谱的概念。茨维特的实验碳酸钙石油醚色谱法？Chromatography色谱法是一种分离方法。特点：有两相，一是固定相（

stationaryphase），一是流动相（mobile

phase），两相作相向运动。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。因此色谱分析是一种分离、分析法。2、色谱法分离原理当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。3、色谱法的分类按流动相状态的不同，可分为以下三类：气相色谱法(Gas

Chromatography,GC)液相色谱法(Liquid

Chromatography，LC)超临界流体色谱(Supercritical

FluidChromatography，SFC)色谱分析仪器流程流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱混合试样在色谱柱中进行分离各组分依次进入检测器检测检测响应信号导入计算机得到色谱图流动相进样装置色谱柱检测器数据记录与处理min05101520253035100806040200DAD1

C,

Sig=270,16

Ref=360,100

(HUm

AU\DSLS-A21.D)气相色谱法？以气体为流动相的色谱法Gas

Chromatogaphy，简称GC按固定相状态的不同可分为：气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)应用范围：用于分离分析易汽化（在-190℃-500℃范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。液相色谱法？以液体为流动相的色谱法Liquid

Chromatography，简称LC应用范围：用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。其他分类方式按固定相使用的形式可分为柱色谱（column

chromatography）将固定相装在色谱柱内纸色谱（P r

Chromatography）

用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（Thin

Lay

Chromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上应用TLC:1

2

3

4

5

6

7

8

9Bands12345678DescriptionPseudoginsenoside

F11American

GinsengGinsenoside

Rg1Ginsenoside

RfGinsengGinsenoside

RcGinsenoside

Rb1NotoginsengNotoginsenoside

R19Identificationof

Ginseng,

America

ginseng

andNotoginseng二、色谱法基本理论拟解决的问题色谱相关术语色谱法理论的概况色谱中的动力学理论色谱分离情况的评价方法影响色谱分离的主要因素及条件选择（从理论的角度加以判断）1、色谱相关术语关于色谱峰关于保留值关于分配平衡关于色谱峰的术语0oo'tMt'RtRA'2CIJABEGFHDWWh/2峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差σ关于色谱峰的术语峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：W=4σ，Wh/2=2.354σ拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基线漂移基线噪声谱带扩张关于保留值的术语死时间（t0，tM）：无保留组分出峰时间保留时间（tR）：R调整保留时间（t’

）：0'RtR

t

t关于保留值的术语死体积（V0，VM）：保留体积（VR）：

VR

tR

Fc调整保留体积（V

’R）：V0

t0

Fc

t

'

Fc

(t

t

)

FcR

R

0RV

'关于保留值的术语相对保留值（ri,s）：Rs

Rs——

相对保留值又称为选择性因子（）——

在气相色谱中，相对保留值的大小仅与固定相种类和柱温有关。V

'V

't

't

'i,s

Ri

Rir关于保留值的术语保留指数（I）：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：Rzlg

t

'

lg

t

'lg

t

'

lg

t

'I

100

R

Rz

100ZR(

z1)关于分配平衡分配系数K（distribution

coefficient

）K

每毫升固定相上溶解（或吸附）溶质的量每毫升流动相上溶质的量关于分配平衡分配比k：又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。t

'Vk

K

S

RVM

t0关于分配平衡相比β：色谱柱内固定相和流动相体积之比是柱型及结构的重要特征。VS

k

K

VM2、色谱基本理论概述研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题——发展高选择性色谱柱色谱动力学问题——发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题——分离条件优化3、色谱动力学理论研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论1.

塔板理论塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：

n

(1

V

)

22

VRn

W2

VR

eC

塔板理论当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量W，是峰高定量的理论基础。当n越大，柱效越大，Cmax/W越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。柱效由流出曲线方程导出：H=L/n)22V1/

2)22V1/

2

5.54(n

8

ln2(W

16(VR

)2VRVR)22t1/

2)22t1/

2

5.54(n

8ln

2(W

16(

tR

)2tRtR柱效n是峰相对展宽的量度n是柱效的量度n是常数时，Y与tR

成正比n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能各组分有被分离的可能性。塔板理论的贡献塔板理论有助于分离过程。形象的理解色谱的导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。塔板理论的局限塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。4.色谱相关术语关于色谱峰关于保留值关于分配平衡关于色谱峰的术语峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差σ峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：W=4σ，Wh/2=2.354σ拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基线漂移基线噪声谱带扩张关于保留值的术语死时间(tM):无保留组分出峰时间保留时间(tR):R调整保留时间(t’):死体积(VM):保留体积(VR):R调整保留体积(V’):VM

tM

F0MRR

t

tt'VR

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F00V

'MRR

t

)

F

t'

F

(tR

0i,s保留指数(I)：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：Rs

Rsi,sV

'V

't

't

'相对保留值(r

):

r

Ri

RiRzlg

t'

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t'lg

t'

lg

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100

R

Rz

100ZR(

z1)要参数。关于分配平衡分配系数K(distribution

coefficient)K

每毫升固定相上溶解(或吸附)溶质的量（..柱温）每毫升流动相上溶质的量分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重VM

tMVt'k

K S

R

相比β色谱柱内固定相和流动相体积之比

VM

KVS

k是柱型及结构的重要特征。二、色谱分析法基本理论研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题——发展高选择性色谱柱色谱动力学问题——发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题——分离条件优化1、色谱动力学理论研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论（1）塔板理论推导塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：C

tRn22

2(ttR

)C

0

e2

为标准偏差当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。当n越大，柱效越大，Cmax/

C0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。22

2C(ttR

)2

C

0

e对色谱流出曲线方程的柱效由流出曲线方程导出：H=L/nn是峰相对展宽的量度n是柱效的量度n是常数时，Y与tR

成正比n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能各组分有被分离的可能性。)2)2Y

16(

tR

)2

5.54(

tRY1/

2n

8

ln

2(

tRY1/

2塔板理论的贡献塔板理论有助于

形象的理解色谱的分离过程。导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。塔板理论的局限塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。速率理论速率理论是1956年荷兰学者Van

Deemter等提出，因此又称作范第姆特方程运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素速率方程的导出根据塔板计算公式：n=5.54(tR/Y1/2)2速率理论

的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu涡流扩散项涡流扩散项均匀性因子A=2λdp粒径涡流扩散项涡流扩散项A：由不等路径造成的色谱峰

扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。分子扩散项B/uB=2γDgZ(t3>t2>t1)弯曲因子扩散系数分子扩散项分子扩散项：由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展传质阻力项平衡浓度固定相传质阻力引起非平衡过程示意图实际浓度流动相分界面气相传质阻力项气相传质阻力项Cg：试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。气相传质阻力项表达式CguCg

=容量因子液相传质阻力项液相传质阻力项CL：试样组分从固定相表

面移动到固定相

的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。液相传质阻力相表达式CL

uCL

=液膜厚度液相扩散系数气相色谱中的速率方程2DgH

2dp

f

upd

2

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(1

k

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2

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2

Dg

3 (1

k

)2

D

L2

k速率方程给 的什么启示为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导对柱型研究和发展的影响A=0?Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube）毛细管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分离能力大大提高对柱型研究和发展的影响B=0?溶质在液体中的扩散系数DL≈10-5cm2/s溶质在气体中的扩散系数Dg≈10-1cm2/sDL

《Dg当采用液体作流动相时B→0液体作流动相时可用更细的固定相，A

↓HPLC柱效比GC要高2~3个数量级操作条件对柱效的影响u/cm.s

-1载气线速度（流速）的影响最佳流速：u=(B/C)1/2实用最佳流速：比最佳流速更快A与流速无关B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用容量因子k的影响不同组分k不同，测出的柱效不同在气相传质阻力相中，k↑，Cg↑理论上说k越小柱效越高，实际不可取在液相传质阻力相中，k

↑，Cl先↑，后↓当k=1时，最大。希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温，固定相，柱型参数等可实现。柱温的影响间接影响、十分复杂对k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断对色谱柱的填充提供理论指导柱径：根据速率方程，柱径越小，柱效越高，但柱径越小，固定相越难填充均匀。柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但柱长增加，分离时间将增加。固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，

A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充，同时A项增大。对色谱柱的填充提供理论指导液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。固定液与担体的配比一般在5:100-25:100之间，但现在更低配比的固定相也应用广泛。更重要的是：不同沸点的物质，应采用不同配比的固定相。影响谱带扩张的其他因素非线性分配色谱载体表面活性吸附中心造成的拖尾柱外效应色谱柱外引起色谱峰扩展的因素：如进样系统及进样方式、系统连接管、检测器死体积，检测器响应时间常数等因素引起的谱带宽展。速率理论方程式的偶合式H=(1/A+1/Cgu)-1+B/u+CluA’=(1/A+1/Cgu)-1为偶合项已被普遍接受2.

色谱分离基本方程对于常规分析工作，一般选用：选择性系数α（相对保留值）与保留指数I来评价固定液有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件以分离度R作为柱的总分离效能指标（1）几个概念——选择性系数α定义与相对保留值(ri,s)基本相同不同之处在于选择性系数是两个相邻峰的调整保留值之比（后峰比前峰，α≥1），而不是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1）它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。几个概念——有效塔板数N有效在气相色谱中，通常用有效塔板数N有效和有效塔板高度H有效来评价柱子的分离效能，它扣除了死体积对分离的影响，更好地反映了柱子的实际分离效能。柱效越高，该柱的分离能力越好。

2

1

/

2

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2

YY

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N

5.54有效几个概念——分离度R21

21

(Y

Y

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tR(1)21/

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2(2)1/

21

(Y

Y

)tR(2)

tR(1)R

R越大，说明两组分分离得越好。由于该定义综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色谱柱的总分离效能指标。(2)色谱分离基本方程（Purnell方程）t

uuuMSSRMSR

R

uS

t

M

L

tR

tM

1

k

mM

1m

m

1

kt

L

，t公式推导41nR

1

k

R

4

tM

1

k(

理论（3）色谱分离基本方程的启示要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施：提高柱效N提高选择性系数α增大容量因子k

R

1

k

4n

1

kN的影响，如何提高N？分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。增加柱长可增加N，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。减小塔板高度H：根据速率方程的启示 一根性能优良的色谱柱是十分重要的。根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。K的影响，如何改变k？分离度与容量因子有关，容量因子越大，分离越好。k

1

3

5

7

9

11

13

∞k/k+1

0.50

0.75

0.83

0.88

0.90

0.92

0.93

1.00但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是

1<k<10。改变容量因子的方法有：改变柱温改变相比，即改变固定相的量和改变柱死体积，其中死体积对k/(k+1)的影响很大，使用死体积大的柱子，分离度将受到很大损失。在高效液相色谱中改变流动相的配比是最简便、最有效的方法α的影响，如何改变α？αN有效R=1.0R=1.51.00∞∞1.00565000014500001.013670001.02940001.057100160001.10190044001.254009001.501403202.0065145α越大，分离效果越好。增大α是提高分离度最有效改变柱温也可改变α。段。因此在气相色谱中，增大α最有效

段是改变固定相，选择合适的固定相种类是解决分离问题的关键在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。样品组分K（

α）50%甲醇/水40%乙腈/水37%THF/水苯胺1.3（1.07）1.5（1.07）1.7（1.35）苯酚1.6（2.81）1.4（2.87）2.3（1.70）苯甲醚4.5（1.04）4.3（1.09）3.9（1.20）苯4.7（1.96）4.7（1.63）4.7（1.38）氯苯9.27.76.5（4）分离度究竟要多大？一般来说R应大于1.5。具体工作中应根据样品要求和定量方法来确定。例如：含量50%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.28，而采用峰面积定量R1/2需1.00。含量1%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.83，而采用峰面积定量R1/2需2.37。3.

气相色谱操作条件的选择流速柱温气化温度检测器温度进样量载气种类固定相种类流速u（Fc）根据速率方程，可计算求出最佳流速，此时柱效最高。在实际工作中，为缩短分析时间，往往使流速稍高于最佳流速。具体的：对于填充柱，氮气的实用最佳线速为10-15cm/s；氢气为15-25cm/s；氦气介于两者之间。若填充柱内径为3mm

，则体积流速为氮气15-25ml/min，氢气30-50ml/min。柱温Tc直接影响分析效能和分析速度。每一种固定液都有它的最高使用温度，柱温不可超过这一温度，否则固定液挥发流失。柱温太高，组分挥发度靠拢，不利于分离。但柱温太低，被测组分的扩散速度下降，分配不能快速达到平衡，影响峰型，柱效下降，并使分析时间大大延长。柱温选择的原则是，在保证难分离物质有良好分离的前提下（分离度满足要求），可以采取较高柱温，以缩短分析时间，保证峰型对称。混合物bp柱温固定液含量>300℃低于bp100-200℃1-3%200-300℃低于bp100℃5-10%100-200℃平均bp的2/310-15%气体室温15-25%吸附剂沸程范围>100℃程序升温具体的汽化温度一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70℃。进样量大时高一些好，保证瞬间汽化。保证不可超过试样的分解温度。其它气化温度与具体进样方式有关。检测器温度一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。进样量液体试样一般进样量0.1-5μl。气体试样一般进样量为0.1-10ml。具体视柱类型，固定液含量（过柱容量）、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。流动相（载气）种类流动相的种类要视检测器种类确定。常用的有氢气（热导用）、氮气（氢火焰用）、氦气（均可用，但价格较高）。氢气和氦气适合于快速分析。氮气做载气峰型较好，柱效较高。三、色谱定性与定量方法人参药材的HPLC图谱518541236

7人参皂苷标准品的HPLC色谱图Rb1Rg1Re丙二酰基人参皂苷Rb1面积归一：Rg1=1.0%,Rb1=3.5%外标法：Rg1=0.2%,

Rb1=0.5%（1）色谱定性分析利用保留值及其规律定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。利用纯物对照定性利用文献值对照定性纯物质对照定性实现方法利用保留时间和保留体积定性用相对保留值定性用已知物增加峰高法定性RsRst'

V

't'

V

'ri,s

Ri

Ri应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其他仪器。缺点：定性结果的

度不高。提高

度的方法：双柱、双体系定性文献值对照定性分析（GC）实现方法测定相对保留值ri,s测定保留指数I优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。与其它仪器或化学方法联合定性离线联用方式化学法仪器法联用方式化学法仪器法离线联用方式收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集应用范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析缺点：麻烦联用方式用化学方法辅助定性柱前反应：在色谱柱前装上预处理柱，带有某些官能团的化合物在预柱中发生物理化学变化，其色谱消失或移动，与反应前色谱图比较，可初步判断试样中含那些官能团。柱后反应：在色谱柱后装上Ｔ型毛细管分流器，将各组分导入官能团试剂反应管，利用官能团反应对组分进行定性。与其它仪器联用定性混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……其它仪器相当于色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。度高，操优点：不需要标准物，定性结果作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。GC-MS（2）色谱定量分析定量基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：m

f

'A

,其中f

'是绝对质量校正因子,A

是峰面积.i

i

i

i

i定量要解决的问题峰面积的测量和计算校正因子的测量与计算色谱定量方法及其应用峰面积的测量与计算积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。手动测量与计算峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。A

h

(Y0.15

Y0.85

)2A

1.065

h

2Y1/

2A

1.0204

h

YA

h

tR峰的测量切线分峰垂线分峰连线分峰计算机拟合分峰校正因子的测量与计算相对校正因子由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际工作中使用相对校正因子。相对校正因子的表达式质量校正因子摩尔校正因子相对响应值i

smAmA

mff

's,mf

'

i,m

s

i

isMAims

MAsmi

Mf

f

's,Mf

'i,M'1iifS

'