现代分子技术在食品检测中的应用课件

现代分子技术在食品检测

中的应用主要内容1PCR技术及其在食品检测中的应用2生物传感器及其在食品检测中的应用3基因芯片及其在食品检测中的应用1PCR技术及其在食品检测

中的应用1953年沃森（Waston)和克里克（Crick)对威尔金斯（MauriceWilkins)DNA的X-射线衍射图分析发现了DNA的双螺旋结构，奠定了现代分子生物研究的基础。他们3人因此获得了1962年的诺贝尔医学和生理学奖。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。ReactionConditionforaTypicalPCRAssay检测常用的PCR技术普通PCR技术巢式、半巢式PCR技术：是一种提高灵敏度的方法。通过设计两对引物，其中一对引物结合的位点在另有所一对引物扩增的产物之中。多重PCR技术：设计一组引物，在一个PCR反应过程中，对多个目的片段进行扩增。实时荧光定量PCR(real—timequantitativepolymerasechainreaction，RQ-PCR)又称荧光定量PCR：就在普通PCR仪的基础上配备了一个激发和检测的装置，实时监控PCR反应的进程。按照PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，加入相应的内对照，对待测样品中的目标基因进行准确定量。具体步骤细菌的培养和基因组DNA的提取接种于EMB固体培养基上进行纯培养，挑一单个菌落复接种到30ml相应增菌液内增菌，提取1ml菌液用甘油保存于-80℃备用。5000r/min离心1min，收集沉淀。用细菌DNA提取试剂盒提取3种细菌DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度，分装数管，-20℃保存备用。单基因PCR扩增及特异性和敏感性分析先对3种菌进行单独扩增，反应体系：模板DNA，上、下游引物各1，dNTP，Taq酶，10×Taq酶bufer，MgC12溶液，其余用无菌的去离子水补足。PCR扩增条件：95℃变性3min，94℃变性50S、54℃退火50S、72℃延伸50s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物在1.5％的凝胶上进行电泳。将3个PCR扩增产物进行回收，然后进行核苷酸序列测定，并与Genbank中发表的相应序列进行比较。PCR技术在食品检测中的应用

1食品加工中外源DNA污染的检测病原微生物的检测掺假量的检测2转基因食品的检测病原微生物的检测常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。表1是一些应用PCR技术检测食物中病原微生物的成功例子。常见的食源性病原微生物的PCR检测试剂盒主要有BioCon—trol公司的肉毒梭菌、大肠杆菌0157：H7、李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名Probelia)和Qual—icon公司的大肠杆菌0157：李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名BAX)等。大量研究表明，PCR技术在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度，而多数情况下则表现出更高的灵敏度，而且检测周期大为缩短。Aabo等对96个碎肉样品中自然污染的沙门氏菌进行检测，结果表明，一种PCR检测方法的检出率达到0.92，而由于样品本身所携带的菌群的干扰，传统方法漏掉了很多阳性样品，检出率仅为0.50。掺假量的检测由于DNA比蛋白质具有更高的热稳定性，与免疫学检测技术相比，利用PCR分析时不需要特异性抗体。特异性抗体的制备时间远远长于合成引物所需要的时间，所以RQ-PCR就成了检测食品掺假量的一种优势选择。SandbergM等人利用RQ—PCR定量检测谷物基因来控制那些缺乏麦麸的婴儿食物。转基因植物所采用的启动予主要为来源于花揶菜花叶病毒的Camv35S启动子、根瘤农杆菌的nos启动子及玄参花叶病毒的FMV35s启动子；广泛应用的终止子分别来源于根瘤农杆菌的nos终止子、花揶菜花叶病毒的camv终止子以及新霉素磷酸转移酶NPtⅡZ终止子。针对这些基因的PCR扩增可涵盖95％的现有的转基因植物的需要。因此通过检测样品是否含有特定启动子、终止子或标志基因序列作为鉴别转基因食品依据是一种可行方法。2生物传感器及其在食品检测中的应用生物传感器是一种新兴的生物技术产品，在分析领域中具有极大的发展潜力和前景，它是由生物活性物质制成、制成的生物功能敏感元件，在配上适当的信号转换器。生物活性物质包括酶、抗原、抗体、细胞器、完整细胞、激素、核酸等。生物传感器具有结构紧凑、操作方便、检测迅速、选择性好、灵敏度高等特点，能够从微量的试样中测定其痕量物质。生物传感器的分类按生物敏感材料的不同分为：酶传感器，免疫传感器，微生物传感器，细胞传感器等。按转换器的不同分为：电化学生物传感器，光生物传感器，声波生物传感器，仿生传感器，生物量传感器等。按生物反应的基本原理分为：催化型和亲和型生物传感器。生物传感器在食品检测中的应用病原菌的检测抗生素残留的检测毒素的检测国内，卢智远等人研制成一种能快速测定乳制品中细菌含量的电化学生物传感器，实验结果表明，该生物传感器能有效的测定鲜奶中的微生物含量。蔡豪斌研制了一种电化学生物传感器对大肠杆菌、啤酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应，并实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及消毒鲜牛奶中的细菌总数。抗生素残留的检测β-内酰胺类抗生素(包括青霉素)常用来治疗奶牛乳房炎，因此它是牛奶中最常见的抗生素残留。2002年，Gustavsson等人用基于生物传感器的表面等离子共振(SPR)设计了检测牛奶中口一内酰胺类抗生素的实验。他们将带有羧肽酶活性的微生物受体蛋白用作探测分子，这种受体蛋白和抗体相比，其优点是只能分辨出活性、完整的β-内酰胺结构。在β-内酰胺类抗生素存在时，受体蛋白和抗生素之间形成稳定的复合物，抑制了蛋白酶的活性，从而可以通过酶活性的降低值，定性地检测出牛奶中的青霉素G。这种方法的检测极限为2.6µg／kg，低于欧洲4µg／kg的最大残留限(MRL)。3基因芯片及其在食品检测中的应用基因芯片(DNA芯片、DNA微阵列)技术是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术，是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，他综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术，在生命科学和信息科学之间架起了一道桥梁，是当今世界上高度交叉、高度综合的前沿学科和研究热点。基因芯片技术的基本原理将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后，制备荧光标记探针，然后再与芯片上的寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品靶分子的数量。基因芯片在食品检测中的应用在食品微生物检测中的应用在转基因食品检测中的应用在食品毒理学研究中的应用在食品微生物检测中的应用DNA微阵列技术被广泛用于食品的快速检测，是因为DNA微阵列技术可以确定某种病原体污染的特异分子标志物，因为这些标志物建立在成千上万个基因之上，即使检测结果只有部分符合这些标志物也能反映病原体的一些特性，根据这些分子标志物而制造的商业化DNA微阵列可以快速灵敏地检测出病原体。DNA微阵列中广泛应用的标志基因是16SrRNA，此外还包括rpoB、recA、gyrB、groEL和atpD等基因。AngelikaLehner等利用DNA微阵列成功地从牛奶中检测出Enterococcusfaecium和Enterococcusfaecalis。GeorgiosKeramas等设计的DNA微阵列3h可以检测6-60fg的Campylobacter基因组，而且成功地检测并区分两个亲缘关系非常近的Campylobacterjejuni和Campylobactercoli。MasafumiIkeda等从新鲜蔬菜中检测出SalmonellaentericaserovarEnteri—tidis、Yersiniaenterocolitica和Bacilluscereus。DNA微阵列技术可以在不同的水平上检测转基因生物的生理和代谢上的变化。如UKFoodsStandardsAgency已建立了西红柿成熟的不同阶段的cDNA文库，由此制造的微阵列不仅可以检测基因表达的变化，而且还可以检测一些部分相关的代谢途径的激活与否。DNA微阵列技术不仅可以检测转基因食品自身基因表达。还可以用来检测食用转基因食品的人或动物的基因表达，从而为转基因食品的安全评价提供更全面、更准确的依据。在食品毒理学研究中的应用饮食补充剂和一些微量元素的使用已成为一个趋势．这些补充剂的功效、安全性和剂量有待进一步研究，饮食中的多种营养物和组分被认为具有化学预防或抗癌作用，可以降低癌症和其他退行性疾病和衰老的发生。已有详实证据表明VA、VC、VE和β-胡萝卜素具有抗癌作用，然而一些具有化学预防作用的物质被大量食用时，会产生一