HPLC中的手性固定相课件

HPLC中的手性固定相概述较之GC、SFC、TLC、CE、CEC，HPLC是最为重要的手段，尤其是在制备级别。过去20年，是HPLC手性固定相快速发展的时期。迄今，已经商品化的HPLC手性固定相约有110余种。通常，手性固定相的制备都较为一致，即选择一个单一对映体固定化在色谱基质上，当被分析物通过时，因为结合后的稳定性或保留性的差异，而实现分离。概述手性识别与对映体的分离是自然界及技术领域的基本现象。手性固定相的分子识别机理与对应的选择性结构，一直受到研究者的关注。但是，其内在的分子机理至今仍未得到阐明。三点作用模型，仍然是解释分子识别机理时使用最多的理论。概述常见商业来源的HPLC中手性固定相的主要结构、识别机理、限制与应用，将是本节主要内容。经典的手性固定相通常被分为配基交换、环糊精、Pirkle型、合成多聚物、多糖、蛋白质、大环抗生素和冠醚类。除此之外，还有许多其他的具有潜在发展前景的手性固定相，但还未达到前述的商业化程度，如环果聚糖、金属复合物、硼包含物等。色谱手性分离技术的合理设计，以及基于高通量筛选与计算化学的新技术在HPLC手性固定相研制中，极有可能成为未来发展的方向。经典手性固定相现有的经典手性固定相，已可满足小分子药物分析领域内的多数手性分离的需要，主要包括药物分析与对映体拆分制备等。根据手性固定相的不同来源，可以分为自然来源的、半合成的、全合成等3大类。经典手性固定相配体交换型手性固定相：1960年代末，最早采用色谱方法对消旋体进行拆分，即为使用一种配体交换型的手性固定相分离氨基酸对映体。将脯氨酸固定化在聚苯乙烯载体上，在流动相中加入Cu（II），由于脯氨酸、金属离子及被分析的氨基酸间非对映的三重复合结构，被分析氨基酸被吸附在中心离子的配位层。通过对该手性分离现象的研究，后来陆续研制出基于硅胶载体的固定相，以及连接其他类型手性固定相的多聚物类型的色谱柱。由环氧树脂作用的（L）脯氨酸结合硅胶是最早上市的手性键合固定相（ChiralProcu，Serva，Heidelberg，Germany）。经典手性固定相配体交换型手性固定相：经典手性固定相环糊精型手性固定相：环糊精从1970年代开始被尝试用于手性分离。环糊精是一类由环形低聚糖构成的杯状化合物，通常由淀粉经环糊精转糖基酶催化得来，含有6（α-环糊精）、7（β-环糊精）或8（γ-环糊精）个经α-（1,4）-糖苷键连接而得到的吡喃型葡萄糖单位。环糊精杯状结构的腔内部，不含有羟基，呈疏水性，而杯状的外沿则是亲水性的。经典手性固定相环糊精型手性固定相：经典手性固定相环糊精型手性固定相：多类化合物通过环糊精得以成功完成手性分离，如β-阻断剂、生物碱、羧酸及其他中性分子等。β-阻断剂类药物，可以直接在天然β-环糊精或γ-环糊精固定相上分离。将环糊精进行磺基化后，可以利用其多重相互作用（如疏水性或静电力），分离中性物质、阴离子或阳离子，该类手性固定相在生物医药领域的应用非常广泛。氨基甲酰化或二醇化的环糊精固定相，用于分离环己烯巴比妥、氯苯吡胺（扑尔敏）等经典手性固定相Pirkle型手性固定相：Pirkle型手性固定相最早于1970年代末由Pirkle课题组研制。该类手性固定相是将小分子手性选择物质键合到固体载体（如硅胶）上得到，通常被称作Pirkle型、刷型或π电子给予或π电子接受型手性固定相。刷型固定相的手性分子主要分布在惰性基质的表面，容易接触到被分析物质。在被分离物与固定相间的主要相互作用是π-π相互作用，同时也存在其他类型的相互作用，如氢键、偶极-偶极作用、空间位阻等。经典手性固定相Pirkle型手性固定相：Pirkle型手性固定相最早于1970年代末由Pirkle课题组研制。该类手性固定相是将小分子手性选择物质键合到固体载体（如硅胶）上得到，通常被称作Pirkle型、刷型或π电子给予或π电子接受型手性固定相。刷型固定相的手性分子主要分布在惰性基质的表面，容易接触到被分析物质。在被分离物与固定相间的主要相互作用是π-π相互作用，同时也存在其他类型的相互作用，如氢键、偶极-偶极作用、空间位阻等。由于良好的载样能力，Pirkle型固定相非常适用于临床前少量药物的HPLC手性分离制备。经典手性固定相Pirkle型手性固定相：由于Pirkle型固定相的主要相互作用是π-π相互作用，因而其主要用于分离含芳香基团的对映体。Pirkle型固定相大都适用于正相HPLC。大多Pirkle型固定相用于分离氨基酸、氨基醇、胺类及某些酸性手性化合物时，可得到较好的拆分能力。经典手性固定相人工合成多聚体型手性固定相：通过加聚反应制备的含手性基团的线性聚合单螺旋聚丙烯酸酯和聚（甲基）丙烯酰胺，是这类手性固定相的主要代表，最早的该类手性固定相是1979年合成的单螺旋三苯甲基-甲基丙烯酸酯。螺旋形是该类固定相产生手性识别能力的主要原因，碳水化合物、醚类、胺类、卤化物和有机含磷化合物都有在该类固定相上分离的成功例子。经典手性固定相人工合成多聚体型手性固定相：经典手性固定相多糖类手性固定相：该类手性固定相可以通过连接各种取代基团到羟基上，而得到各种不同手性识别能力的HPLC固定相。该类物质的手性识别能力，被归因到具有手性的碳水化合物单体及其很长的螺旋形二级结构。多糖含有众多的可能作用位点，因而可用于分析种类众多的待测物。多糖使用非常广泛，在所有手性固定相中，其可分离物质的种类仅次于蛋白质，但其载样量远大于蛋白质类固定相。经典手性固定相多糖类手性固定相：在2003年统计的文献中，85%的手性HPLC使用多糖类手性固定相；而2005年的文献统计中，90%的手性HPLC固定相为多糖类。大约200种不同的基于纤维素、直链淀粉、几丁质、壳聚糖、半乳糖胺、凝乳、右旋糖酐、木聚糖和菊糖等的衍生物被用于制备具有手性识别能力的HPLC固定相。纤维素和直链淀粉衍生物，体现了更高的手性识别能力，尤其是苯基氨基甲酸酯和安息香酸酯类衍生物。1970年，微晶纤维素三醋酸酯成为第一个被用于实践的多糖类手性固定相，并在1984年采用表面涂覆在大孔二氧化硅基质上的方式，制备了首个商品化多糖类手性固定相。经典手性固定相蛋白质类手性固定相：用于手性分析的蛋白质，通常都来源于自然界。由于氨基酸的排列顺序和糖基化程度的不同，蛋白质具有不同的三维结构，并在三维结构的不同位点上，存在着各类相互作用的位点，这一结构特点是蛋白质具备手性识别能力的主因。牛血清白蛋白是最早用于手性分离的蛋白质，之后出现了固定化的牛血清白蛋白和α-酸性糖蛋白HPLC固定相。尽管易于获得，蛋白质类手性固定相存在载样量小、低分离效能、容易变性等特点，同时其流动相的pH值、离子强度和有机相组成等也受到限制。经典手性固定相蛋白质类手性固定相：最早的基于牛血清白蛋白的色谱柱，曾被成功用于N-衍生化氨基酸、芳香氨基酸、不带电荷物等。α-酸性糖蛋白类手性固定相则被报道用于青霉胺类对映体的制备和分析。基于人血清白蛋白的手性固定相，则被用于分离布洛芬、酮洛芬和苯并二氮杂卓类药物的分析。经典手性固定相大环抗生素类手性固定相：1994年，大环抗生素类首次作为手性固定相，用于分离氨基酸类对映体。大环抗生素类手性固定相也是常用固定相之一，次于多糖类和环糊精类。与其他手性选择体不同，大环抗生素类在结构上具有显著的多样性，如大环多烯-多羟基化合物、柄状化合物、大环糖肽、多肽和肽杂环类化合物。结构上的多样性，使得该类固定相有可能提供多种相互作用方式，如疏水作用、偶极-偶极作用、π-π相互作用、氢键连接及立体位阻等。经典手性固定相冠醚类手性固定相：冠醚最早用于1967年，是一种大环聚醚，其分子立体结构中具有一个特定大小的空腔。冠醚结构上的氧，作为受电子基团，分布在空腔的内侧壁，使得金属或铵离子可以进入到该空腔内。1979年，有人将双（1,19-联萘）-22-冠-6固定化到聚苯乙烯和硅胶基体上，得到首个基于冠醚的手性固定相。通过将多种手性芳香环连接到冠醚骨架上形成手性屏障，可以得到多种手性冠醚，如含联萘、联菲单位、手性螺旋衍生，以及某些自然产生的手性分子，如酒石酸或碳水化合物。经典手性固定相冠醚类手性固定相：冠醚手性固定相主要用于分离含初级胺基手性中心的物质，如氨基酸及其衍生物。主要有2种冠醚类固定相被广泛应用，而且有商品化的供应，如下表。一个结合了3,3’-联苯-1,1’-联萘，其他的结合了酒石酸。前者曾被用于分离α-氨基酸、1-苯基-乙胺及3-氨基己内酰胺、β-氨基酸、芳基-α-氨基酮及氟代喹诺酮等，而后者则被用于分离α-氨基酸、丙氨酸-β-萘胺、氨基醇、1-（1-萘基）乙胺、α-甲基-色胺等。手性固定相的新发展现有的可以获得的手性固定相，其中涉及到的设计与手段，比上述更多。然而，特定的结构类型和新的手性固定相的观念，在其发展过程中仍十分重要，如某些化合物立体中心是非极性的，不能提供氢键连接或其他相互作用基团，某些化合物含有多个手性中心，以及相当数量的手性胺等。扩展手性选择体的种类，一直是手性研究的重点。随着药学领域内对手性化合物了解深入的需要，手性固定相研发吸引了全世界研究者的热情与努力，也使得一批新的手性固定相商品产生。这些新商品，一方面是新的手性选择体的拓展，另一方面，对现有选择体的固定化方式及载体材料等也有新的发展。手性固定相的新发展传统手性固定相的改进：传统手性固定相本身多具有较好特异性和立体选择性，经衍生化改进后，该方面特性得以进一步彰显。基于多糖的手性固定相，纤维素三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯），可同时分离23种氨基酸衍生物中的19种；几丁质三（3-氯苯基氨基甲酸酯）衍生物分离速度，较常用的ChiralcelOD-H和ChiralpakAD-H更快；单-6-脱氧-（2,4-二氢苯甲亚胺）-β-环糊精手性固定相，可用于在反相HPLC中分离1-苯-2-硝基乙醇；多种类型的环糊精手性固定相，均可使用氢化硅烷化的方式连接到多孔硅胶。手性固定相的新发展环果聚糖类：此类手性固定相来源于环果聚糖衍生化。该类化合物易于制备，对某些特定化合物具有优良的手性识别能力，且在分离时对条件适应性好，解决了以往某些化合物手性拆分方面缺少合适手性固定相的不足。手性固定相的新发展环果聚糖类：最早见于报道的环果聚糖用于手性分离，见于2009年。环果聚糖的载样潜力大，可用于对某些对映体的纯化制备。环果聚糖是包含β-2,1-糖苷键的（D）-呋喃果糖单位的环状低聚糖，含有6-8个果糖单位的聚合体分别以CF6、CF7或CF8的简写形式表达。其手性识别能力，来源于其复合结构，每一个呋喃果糖单位中含有4个立体异构中心。衍生化后的环果聚糖选择体能对手性分离效果产生影响，尤其是分子结构中含有伯胺官能团时（如氨基酸、氨基醇和二胺等）。环果聚糖最早的应用是在CF6和CF7上分离氨基酸酯。手性固定相的新发展金属复合物键合手性固定相：1981年，将金属螯合物吸附到胶性粘土上来分离手性化合物，使用被吸附到高岭石上的λ-钌（1,10-邻二氮杂菲）金属螯合物，分离了芳香化合物2,3-二苯基吡嗪和联萘类化合物，这是该类手性固定相的首次使用。Cu（II）复合物用作手性选择体分离氨基酸也于2003年报道。基于硅胶的钌复合物键合手性固定相最近已被开发出来。

手性固定相的新发展金属复合物键合手性固定相：这种新的手性固定相在正相色谱中，对联萘类物质有很好的分离度，其原因可能是手性识别中π-π相互作用有较大影响。在极性模式中对酸性物质作手性识别时，氢键、静电与偶极作用可能起主要作用。手性固定相的新发展含硼手性固定相：基于硼霉素的手性固定相于2007年被报道为有效的手性选择体。作为大环抗生素，硼霉素含有硼酸和一个手性多羟基大环配体，尤其适合用于分离一大类含伯胺化合物的手性分离。该类手性固定相的识别机理，与手性选择性连接位点的属性和位置相关。其中，硼是立体属性中心，对手性分子识别至关重要。手性固定相的新发展离子性液体手性固定相：离子性液体指一类熔点接近室温的准有机盐类，包括多原子无机阴离子（如六氟磷酸根PF6-）和阳离子（如吡啶盐）。在1914年报道的硝酸乙铵是首个低熔点有机盐，其在室温条件下为液体。离子性液体最近被视为化学反应与分离过程中的绿色物质，这些新的物质有许多优点，如宽液体范围、低挥发性、良好的耐热性、导电性能、宽粘度范围、可调节的混合性能、可重复使用、无可燃性等。以往的研究中，多考虑采用离子性液体作流动相，而用其作为手性固定相的研究很少。手性固定相的新发展离子性液体手性固定相：通过将1,2-二甲基咪唑或1-氨基-1,2,3-三唑处理的6-甲苯磺酰基-β-环糊精键合到硅胶基质，可分离数十种芳香醇衍生物。与β-环糊精手性固定相相比，在分离相当部分的消旋体药物时，包含有离子性组分的手性固定相表现出更好的手性分离能力。手性固定相的新发展不对称有机催化剂：与人工合成的金属催化剂相比，该类催化剂易于制备，且成本较低。有机催化剂在不对称合成中应用广泛，其导致手性的机理是否源于与载体键合的有机催化剂可用HPLC方法来探索。金刚烷基和新戊基衍生化的奎宁（AN-QN）和奎尼丁（AN-QD）曾被用于分离6个消旋化的α-氨基酸衍生物。奎宁的三丁基氨基甲酸酯被固定化到硅胶表面后可分离扁桃酸及其衍生物。该类手性固定相同时有效分离和良好的载样量，在手性分离过程中十分稳定。手性固定相的新发展整体柱技术：整体柱的优势在于其一次成型结构中的孔道网络类型。整体柱的制备是通过色谱柱内的聚合反应来实现，通常是在毛细管柱内，因此，这些色谱柱有远高于常规柱的孔洞率，颗粒填充更为致密，背压更小，从而实现更高的分离效率。其组成主要有2类物质：有机聚合物和基于硅胶的键合物，其中后者的使用更多。手性整体柱研究多使用纯硅胶或经烷基或氨基修饰后的硅胶整体柱，但没有实现商品化的该类手性固定相出现。手性固定相设计的趋势对于手性分离而言，正确的选择或合理的设计一个手性选择性好、高效率手性固定相是最为关键的一步。手性固定相的合理设计是自手性分离工作被提出之时，即已吸引大量研究者投身于手性固定相的开发，并作出了许多卓有成效的工作。但是，目前为止，对合适色谱柱及其适宜的操作条件的可靠预测，仍然是一个尚未实现的科学目标。手性固定相设计的趋势合理的设计准则：官能团具有高的方向性，氢键结合的受或供体位置常在立体属性要素的邻近区域，可以部分地产生高立体选择性；构象的同质性对手性选择性识别有利；手性选择体被固定化在基质上，组成热学上、化学上、以及立体化学上的稳定连接（可保证较宽泛的流动相通用性和低的柱流失），而将活性位点暴漏到流动的流动相中去；手性固定相设计的趋势合理的设计准则：手性片段的几何排列应使得其中一种对映体获得最大保留特性；原色谱效率，可通过去除基质表面的非手性强相互作用位点，以及在表面修饰过程中避免过厚聚合物层的形成来得以保存。手性固定相设计的趋势手性固定相筛选技术的应用：新设计手性固定相的高通量合成与筛选已有很多成果，但是不可能穷尽所有的可能性，所以某些聚焦于或指向