测定糖化酶活性的方法

关于测定糖化酶活性的方法第1页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯上的名称，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace)。多应用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以及白酒、黄酒。糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖化酶是食品工业中常用的一种酶。第2页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a-1,4糖苷键,切下一个个葡萄糖单元，并像β-淀粉酶一样,使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a-1,6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3连接的碳链，但水解a-1,4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。第3页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五酶活测定方法

测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS)等方法。

我们采用次碘酸钠法来测定糖化酶的活性。第4页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是4～6,温度范围是40～60℃）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。次碘酸钠法：碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6

作用的NaIO可转变成I2

析出,因此只要用Na2S2O3

标准溶液滴定析出的I2

，便可计算出未参与反应的NaIO，由此推导出糖化酶催化所产生的C6H12O6

的含量。第5页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五具体步骤

1.I2

与NaOH作用:I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2.C6H12O6

与NaIO定量作用:C6H12O6+NaIO=C6H12O7+NaI第6页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五3.C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发生歧化反应:3NaIO=NaIO3+2NaI4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2:NaIO3+5NaI+6H2SO4=3I2+6Na2SO4+3H2O5.析出的I2

可用标准Na2S2O3

溶液滴定之:I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI第7页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五注：在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1molNaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2

相当。只要得出对照组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。第8页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五对照组实验组I2NaIONaIO另一部分歧化反应生成NaIO3NaIO一部分与葡萄糖反应I2I2NaIONaIO3I2完全歧化反应，无葡萄糖第9页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五试剂与器材1.糖化酶试剂；2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平；3.试剂

2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液；0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液；2mol/L硫酸溶液；0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。第10页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五操作步骤1.取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40℃水浴中预热10min。2.加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40℃，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。第11页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，缓慢加入0.1mol/LNaOH溶液5ml(注意:加碱速度不能过快,否则过量NaIO来不及氧化C6H12O6

而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3

和NaI,使测定结果偏低)，摇匀后在暗处放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）；第12页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五

计算

(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：

酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2）×180.1×（8/5）×2×（60/10）式中:B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；

A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）；

N——硫代硫酸钠的当量浓度。

180.1——葡萄糖的摩尔质量。

8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。

2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。

60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。第13页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五（2）在上述条件下，1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）：酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3×（N/2）×（8/5）×106×2

×（1/10）式中符号与前式相同，其中：

10-3——ml换算成L。

106——μmol换算成mol。第14页，共16页，2022年，5月20日，6点4分，星期五反应试剂配制方法（1）2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。

（2）0.2mol/LpH4.6醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。

（3）0.1mol/L碘液称取13g碘及35g碘