药监系统官方培训 杨美琴 微生物计数数据的可变性与检验结果的复测复验 中检院

微生物计数数据的可变性与检验结果的复测复验中检院微生物室杨美琴2019.11

广州一、微生物计数数据的可变性通过方法评价产品微生物污染的数量风险。污染不均匀小样本抽样，代计数检查产品合格判断样品有限。（10g，10ml）TSA，30-35℃—

氧菌总数SDA，20-25

—霉菌和酵母菌总数R2A，

30-35℃—纯化水微生物抑菌效力评价生物指示剂计数…一、微生物计数数据的可变性不确定度评定微生物概率密度分布标准计数数据可变性2倍因子检测方法/一、微生物计数数据的可变性一、微生物计数数据的可变性

测量不确定度评定一、微生物计数数据的可变性

测量不确定度评估过程（化学分析）计数检查项目：第一步

确定被测量TAMC、TYMC、纯水、培养基适用性、计数方法适用性…第二步

识别不确定度来源第三步

量化不确定度分量检测过程：称重、量取、稀释、培养…第四步

合成不确定度，计算扩展不确定度。微生物测量不确定

评定时可能不一定适用，但分析问题的思路是相通的。

蒙特卡洛方法、bottom-up、top-down（GBT27420-2018

合格评定

生物样本测定不确定度评定与表示应用指南）

黑匣子（SNT4091-2015

食品微生物学测量不估指南）

……一、微生物计数数据的可变性

测量不确定度评估过程Y一、微生物计数数据的可变性SNT4091-2015食品微生物学测量不确定度评估指南一、微生物计数数据的可变性SNT4091-2015食品微生物学测量不确定度评估指南实验室内再现性标准偏差（SR）扩展不确定度：U=2SR（包含因子2，置信水平95%）=0.3log10തU푌

=

푌ത*

0.5

2.0푋

=

푋

（

，

）一、微生物计数数据的可变性SNT4091-2015食品微生物学测量不确定度评估指南一、微生物计数数据的可变性各种评定，重复测量次数在10次左右，讨论微生物计数结果何用？都要做？一、微生物计数数据的可变性不确定度评定微生物计数数据可变性概率密度分布标准2倍因子检测方件一、微生物计数数据的可变性

100ml供试液，含菌??cfu/ml

测试结果（cfu/ml）：234453710442325452724

2

3

4

5

7

10

0估值e

−kP(X

=

k)

=k!一、微生物计数数据的可变性微生物计数的概率密度函数λ<20cfu/ml，呈泊松分布λ>20cfu/ml，泊松分布-正态分布0.25200.10λ=25cfu/mlλ=100cfu/mlλ=4cfu/ml=5cfu/ml0.060.040.020.0050.001214161811011211411357911131517kke−kP(X

=

k)

=k!一、微生物计数数据的可变性微生物计数的实际情况

1、太多：TNTC(toonumeroustoc

nt)

分布不匀，点计不清，降低计数准确度。

2

太少：

泊松分布中，μ和σ2都为λ

随机误差大，降低计数准确度

1cfu/皿，误判可能性100%

30cfu/皿可能性18%

3、合适？120100806040200

细菌&酵母菌：25（20%误差）-20（6.3%误差）

cfu/皿真菌：8-80cfu/皿

薄膜过滤、空气采

…010203040USP<1227>cfu/皿

微生物检测方法

LOQ（定量限）和LDQ（检测限）一、微生物计数数据的可变性不确定度评定微生物计数数据可变性概率密度分布标准2倍因子检测方方法回收率、供试液取样、培养体系、样品中微生物稳定性……法件一、微生物计数数据的可变性

企业纯化水监测结果

Chp标准要求不得过100cfu/ml

企业1检测方法：1ml取样业2检测方法：5ml取样某出水口≤500cfu/5ml1天2天3天4天5天6天7天8天9天10天…1081

分析39242941171378…

薄膜过滤o

皿法

操作误差中微生物数量会随放置时间增加而增加。

严格稳定的操作方法

高污染口梯度稀释后计数

增大取样量，减小随机

…。一、微生物计数数据的可变性制剂类型TAMC102TYMC1010cfu/g（ml）时

标准要求为

检测条件：1:10供试液，1ml/皿，NMT

1cfu/皿✓

<1cfu/皿，

<10cfu/g（ml）口服给药固/液体口腔黏膜龈/鼻用102102102101101101✓

=1cfu/皿，10cfu/g（ml），是否超出标准限值？肤

标准要求为100cfu/g（ml）呼吸道吸入检测条件1：1:10供试液，1ml/皿，NMT10cfu/皿

检测条件2：1:50供试液，

1ml/皿，NMT2cfu/皿

检测条件3：1:100供试液，1ml/皿，NMT1cfu/皿阴道/尿道102102101102直肠给药固/液体其他局部给药102102LimitOfDetecton

检测限•

结果120100806040200LOD时，

=1cfu/皿合格与否？–

或者，制定为产品的警戒限？–

或者，取1g（ml）样品测试，05101520253035减少结果

判的可能？cfu/皿一、微生物计数数据的可变性某品种污染霉菌1:10601:100151:500点计14•

产品不合格•

具体污染了多少？•

是否存在真菌毒素？结果1cfu/g）600cfu/g1201500cfu/g142000cfu/g2点计2结果2（cfu/g）1200cfu/g

1400cfu/g2000cfu/g•

没有讨论方法适用性。•

增加检测稀释级，剔除样本基质的抗性影响。某品

污染细菌1:1031:10026点计1结果1（cfu/g）30cfu/g260cfu/g•

抗生素不适用。一、微生物计数数据的可变性

样品中不稳定的微生物

污染微生物对培养基敏感度不同需氧菌总数（cfu/ml）若规定TAMC不得过1000cfu/g培养基编号需氧菌总数（cfu/g）检测1-1<10检测1-2<10检测360检测42400260ABCDEFGH310合格1700200不合格合格0<10<10<10<103400/3011017002300770160合格<10<10940213225合格合格合格<10<1015005700110002600001

0034

0370062003600800016000/7

31640合格/对照培养基不合格什么菌？怎么用？怎么评价？一、微生物计数数据的可变性From:中国药

:

四部[S].

2015:通则

9203.1.Stressed

organismsmay

bepresent

indrug

productsat

lowlevelsanda

e

oftendifficult

todetect.

Accordingly,

validation

ofmicrobialrecov

ry

methodsforuseonpharmaceutical

products

shouldincludetheuseofstressedorganisms.2.

Test

methodsvalidation

should

addressmultiple

trains

ofthespecies

andcells

that

acclimated

tothe

environments

(e.g.,warmorcoldwater)

that

may

betested.From：FDA.

Warning

Letter[EB/OL].

(200-18)FDA.ProductQuality

Microbiology

Review[EB/OL].

(2011-05-02)一、微生物计数数据的可变性不确定度评定微生物计数数据可变性标准概率密度分布2倍因子检测方法件一、微生物计数数据的可变性基质效应

1、取样：药品内微生物分布不均。

2、稀释：供试液制备操作步骤

，误差

。

3、分配：供试液中微生物分布不均。

4、生长培养：1cell生成1cfu？

ncell生成1cfu？希望得到单细胞菌落，cfu样品中的微生物单细胞形态（供试液分散制备）培养Colony-FormingUnits（cells）单位体积内微生物呈泊松分布一、微生物计数数据的可变性各品种项下规定的需氧菌总数、霉菌

酵母菌总数标准解释如下：Acceptan

criterion:

107

CFU/gM

mum

acceptable

count:

50

000

000

CFU/g二、检验结果的复验与复测（试）样品检验假定某样品需氧菌总数1800cfu/g供试液条件1:1001:10cfu/皿小于20cfu约30%14100-200cfu误差约10%160点计结果min用哪一级结果报告？实验室SOP明确。点计结果max23200二、检验结果的复验与复测（试）

落实复验/试—微生物计数检查原检单位复试

参照《中国药典》？

2015版没有收载具体要求；

2010版，2005版？

法规的落脚点在各检测机构的微生物实验室

有法可依复验单位复验

复试如何取样？

多检查结果出报告？

是否出具不合格报告？各微生物实验室✓

法规要求药品检验机构、药企QC✓

概念差别✓

品种特点药品检验抽

质量管理办法药管理法✓

执行二、检验结果的复验与复测（试）

《中华人民共和国药品管理法》✓

1984年制定，2001年首次全面修订，2019年第二次系统性修订。✓

2019年8月26日，第十三届全国人民代表大会常务委员会十二次会议，决定2019年12月1日执行。二、检验结果的复验与复测（试）

《药品质量抽查检验管理办法》✓

2019年8月19日公布执行。第品检验2006版第五章

复验第四章

药品的检验和复验第六章

监督管理二、检验结果的复验与复测（试）

《药品质量抽查检验管理办法》关于不受理复验的相关修订：二、检验结果的复验与复测（试）第十章

质量控制与质量保证第一节

质量控制实验室管理第五节

偏差处理第六节

纠正措施及预防措施二、检验结果的复验与复测（试）生产质量控制实验室药品检验机构

What，When复测（试）？

OOS，OOT，OOE

Why复测（试）？

为了更完整的估算检测量

How，Who复测（试）？实验室内部规程二、检验结果的复验与复测（试）

生产质量控制实验室

Deviation：Out

of…

Specification

Expect

Trend根据评估需求，进行附加测试评价。

基于累积数据进行不确定评估分析。ത2δ푌

=

푌ത3δ푌

=

푌某出水口1天

2天

34天

5天

6天

7天

8天

9天

10天

…39

24

29

41

17

13

78

…≤500cfu/5ml

1081二、检验结果的复验与复测（试）

程序严格性

按照《药品质量抽查检验管理办法》受理：时限。

检验时限：25个工作日2018年-：

基于时限、样本量

检验程序的合法合理

培适用性方法适用性讨论

稀释级

平皿、薄膜…二、检验结果的复验与复测（试）

十余年复验

35次复验，32品种，57批次

26个各级药品检验所

涉及三版药典二、检验结果的复验与复测（试）

液体制剂较固体制剂的微生物污染的不均一性更大。

检验结果，包装容器间差异大。

水性环境中，污染微生物的特殊性。品种数

批次

与原结论一致全品种324571438（67%）8（57%）液体制剂品种名称批次

复验结论复方甘草口服溶液2011复方甘草口服溶液2019依马打正红花油11合格不合格合格4合格5不合格肠泰合剂92菌体生长慢（5-7天），相较于膜法贴膜培养方式，注皿生长更慢。乳果糖口服溶液不合格二、检验结果的复验与复测（试）

化学药品：大多为需氧菌总数不合格。高水活度产品更容易不合格。品种数批次与原结论一致学药品,7批,全品种324571738（67%）15（88%）30%化学药品中成药,40批,70%品种名称批次复验结论阿昔洛韦乳膏丁酸氢化可的松乳膏乳果糖口服溶液胰酶散12合格1批合格，1批不合格均不合格与普遍化学药品有差距，产品工艺个例。212均不合格二、检验结果的复验与复测（试）重复取样样批

需氧菌总数（cfu/ml）检测

-1

检测1-2

检测2

检测3霉菌和酵母菌菌总数（cfu/g）13018015585110140801234561234567