质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤精编资料

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤精品资料质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 -修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R-，M-）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA分子的细胞）。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人Bcl-2重组质粒转化 DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA。【试剂与器材】仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢2精品资料1．LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。2．LB固体培养基LB液体培养基中加 1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。3．0.1mol/LCaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。4．氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml溶液，置-20℃保存。5．人Bcl-2重组质粒它是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS(-)载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为 4861bp，前者是一种由 pUC19质粒衍生而来的具有 2961bp的质粒载体。因此用 EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μ。6．大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌．恒温水浴箱．超净工作台．高速冷冻离心机．恒温摇床．恒温箱仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢3精品资料．消毒离心管．消毒tips．玻璃培养皿直径90mm．玻璃涂布器．95%乙醇．标记笔【操作步骤】．细菌感受态细胞的制备将DH5α菌种划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于 5mlLB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml接种至含有100mlLB培养基的烧瓶中， 37℃剧烈振荡培养至约 2～3h，待A600值达到0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴 10～15min。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。4000×g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/LCaCl2重悬菌体，置冰浴30min。4000×g，4℃离心10min，弃培养基。再加 4ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻轻重悬菌体，置 4℃冰箱12～16h。2．DNA重组子的转化大肠杆菌 DH5α仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢4精品资料本实验中的DNA重组子为人Bcl-2重组质粒。在无菌条件下按每管取 200μl新鲜感受态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中，共 2管，分别加入人Bcl-2重组质粒(10ng)和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min。42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以 150r/min速度振摇45min，使细菌复苏。每管取 200μl加至含氨苄青霉素（ Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min，使液体吸收，然后 37℃倒置