2022年医学专题-细菌内毒素检查法干扰试验

细菌(xìjūn)内毒素检查法干扰试验讲解董光宴

湛江博康海洋生物有限公司第一页，共三十九页。10/27/20221博康实验(shíyàn)基本流程图供试品限值确定(quèdìng)最大有效(yǒuxiào)稀释倍数确定供试品干扰实验

正式实验结果判断第二页，共三十九页。10/27/20222博康供试品

新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于(chǔyú)新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。第三页，共三十九页。10/27/20223博康

供试品在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息(xìnxī)，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。第四页，共三十九页。10/27/20224博康限值的确定

1、依据2010年版《中国药典》附录“细菌内毒素检查用水”2010年版《中国药典》二部附录“化学药品注射剂安全性检查法应用指导(zhǐdǎo)原则”第五页，共三十九页。10/27/20225博康干扰试验当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境(huánjìng)中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。——2010版药典

第六页，共三十九页。10/27/20226博康干扰试验药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查(jiǎnchá)，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查(jiǎnchá)的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查(jiǎnchá)。——2010版《中国药品检验标准操作规范》第七页，共三十九页。10/27/20227博康干扰试验干扰实验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。——2010版《中国(zhōnɡɡuó)药品检验标准操作规范》第八页，共三十九页。10/27/20228博康干扰试验由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关(wúguān)，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（如0.50或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。——2010版《中国药品检验标准操作规范》第九页，共三十九页。10/27/20229博康举例(jǔlì):1试剂和样品鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，灵敏度：0.25EU/ml）细菌内毒素检查用水细菌内毒素工作标准品（中检所提供）西咪替丁氯化钠注射液（【规格】50ml:西咪替丁0.2g与氯化钠0.45gP258）第十页，共三十九页。10/27/202210博康2限值的确定内毒素限值L=0.50EU/ml（2010年版《中国(zhōnɡɡuó)药典》二部正文258页）。

第十一页，共三十九页。10/27/202211博康3干扰试验浓度的计算按照(ànzhào)中国药典2005年版提供的公式计算最大有效稀释倍数，计算方法如下：3.1选用灵敏度为：0.25EU/ml时：MVD=CL/λ=1×0.5/0.25=2倍3.2选用灵敏度为：0.125EU/ml时：MVD=CL/λ=1×0.5/0.125=4倍第十二页，共三十九页。10/27/202212博康4预试验4.1目的初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示）,为正式干扰试验提供(tígōng)依据。优点：减少摸索过程、节省成本第十三页，共三十九页。10/27/202213博康4.2操作方法由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所用鲎试剂的灵敏度无关(wúguān)，因此在干扰试验的预试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰试验造成的阳性影响。第十四页，共三十九页。10/27/202214博康将供试品溶液进行一系列倍数(bèishù)的稀释，但最大的稀释倍数(bèishù)不得超过MVD=CL/λ0.03使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0λ浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）。另做2支阴性对照，和2支阳性对照。第十五页，共三十九页。10/27/202215博康4.3结果判断当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下可能无干扰，可选择(xuǎnzé)该稀释倍数进行正式干扰实验。第十六页，共三十九页。10/27/202216博康样品信息结果2倍4倍8倍0.25EU/ml0.25EU/ml0.25EU/mlPPC++++++样品管------PC++NC--4.4结果(jiēguǒ)记录第十七页，共三十九页。10/27/202217博康

预试验结果，样品西咪替丁氯化钠注射液在2-8倍稀释范围内不存在明显(míngxiǎn)的增强和抑制作用，可选用其中任一浓度做该样品的细菌内毒素干扰试验。第十八页，共三十九页。10/27/202218博康5干扰(gānrǎo)试验溶液的制备溶液名称WSE/被加入内毒素的溶液稀释用液倍数WSE管数供试品无/供试品溶液———2Et

2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444ES

2λ/BETBET12482λ1λ0.5λ0.25λ4444NC无/BET———2第十九页，共三十九页。10/27/202219博康5.1供试品溶液样品西咪替丁氯化钠注射液的稀释：用细菌内毒素检查用水将其稀释到2倍和4倍稀释液备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质(wùzhì)的干扰。第二十页，共三十九页。10/27/202220博康西咪替丁氯化钠注射液原液2倍稀释液4倍稀释液2.0ml2.0ml0.5ml0.5ml图示第二十一页，共三十九页。10/27/202221博康5.2鲎试剂(shìjì)灵敏度的对照系列根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1ml溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml等6个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

第二十二页，共三十九页。10/27/202222博康150EU/ml15EU/ml2EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.06EU/ml0.2ml0.3ml1.8ml1.95ml1.2ml1.2ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml图示第二十三页，共三十九页。10/27/202223博康5.3干扰(gānrǎo)试验系列的制备方法①、鲎试剂为0.25EU/ml样品浓度为2倍稀释的干扰试验系列溶液的制备：取西咪替丁氯化钠注射液的原液0.6ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为1.0EU/ml）加入同一试管中，混合均匀即得到含内毒素为0.50EU/ml并同时含样品西咪替丁氯化钠注射液的2倍稀释的混合液。第二十四页，共三十九页。10/27/202224博康然后用样品西咪替丁氯化钠注射液的2倍稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀连同该混合液即可得到(dédào)含内毒素分别为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml，含样品西咪替丁氯化钠注射液浓度为2倍稀释液的标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。第二十五页，共三十九页。10/27/202225博康样品(yàngpǐn)原液内毒素1.0EU/ml图示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml样品(yàngpǐn)2倍0.3ml0.6ml0.6ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.50EU/ml第二十六页，共三十九页。10/27/202226博康②、鲎试剂为0.125EU/ml样品浓度为4倍稀释的干扰试验系列溶液(róngyè)的制备：取西咪替丁氯化钠注射液的的2倍稀释液0.6ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为0.5EU/ml）加入同一试管中，混合均匀即得到含内毒素为0.25EU/ml并同时含样品西咪替丁氯化钠注射液的4倍稀释的混合液。第二十七页，共三十九页。10/27/202227博康然后用样品西咪替丁氯化钠注射液的4倍稀释(xīshì)液稀释(xīshì)该混合液，稀释(xīshì)倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀连同该混合液即可得到含内毒素分别为0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml，含样品西咪替丁氯化钠注射液浓度为4倍稀释(xīshì)液的标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。第二十八页，共三十九页。10/27/202228博康样品(yàngpǐn)2倍内毒素0.5EU/ml图示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml样品(yàngpǐn)4倍0.3ml0.6ml0.6ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.25EU/ml第二十九页，共三十九页。10/27/202229博康6干扰(gānrǎo)试验加样

WSE对照名称2λλ0.5λ0.25λNCESET第三十页，共三十九页。10/27/202230博康

7干扰试验判断的标准当Es在0.5λ—2.0λ(包括(bāokuò)0.5λ和2.0λ)时，且当Et在0.5Es—2.0Es(包括(bāokuò)0.5Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用。第三十一页，共三十九页。10/27/202231博康7.1如所用鲎试剂(shìjì)灵敏度为0.25EU/ml，供试品为XX注射液（稀释4倍）WSE对照名称0.50.250.1250.06NC结果ES++++++++------0.25ET++++++++++++-----0.125

Es在0.5λ—2.0λ，且Et在0.5Es—2.0Es(包括(bāokuò)0.5Es和2.0Es)，认为供试品在该浓度下无干扰作用。第三十二页，共三十九页。10/27/202232博康7.2如所用鲎试剂(shìjì)灵敏度为0.25EU/ml，供试品为XX注射液（稀释4倍）WSE对照名称0.50.250.1250.06NC结果ES++++++++++++----0.125ET+++++-----------0.42

虽然Es在0.5λ—2.0λ范围内，Et不在0.5Es—2.0Es范围内，供试品在该浓度下有干扰(gānrǎo)作用，需进行适当处理后重做试验。

第三十三页，共三十九页。10/27/202233博康7.3如所用(suǒyònɡ)鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，供试品为XX注射液（稀释4倍）WSE对照名称0.50.250.1250.06NC结果ES+++++++++++++----0.10ET++++++++--------0.25

Es不在0.5λ—2.0λ范围(fànwéi)内，试验无效。第三十四页，共三十九页。1