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文档简介
2003年4月14日宣布(xuānbù)人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。人类基因组:指DNA分子(fēnzǐ)所携带的全部遗传信息。蛋白质组:生物个体(gètǐ)表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究第一页,共三十九页。第二页,共三十九页。蛋白质别离(fēnlí)的原理:根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质(xìngzhì)和多少、溶解度、吸附性质(xìngzhì)和对其他分子的亲和力等等,可以用来别离不同种类的蛋白质。一、根底知识第三页,共三十九页。〔一〕凝胶色谱法2.凝胶:大多数凝胶是由多糖类化合物〔如葡聚糖或琼脂糖〕构成的多孔小球体,内部有许多(xǔduō)贯穿的通道。根据被别离物质的蛋白质相对分子质量的大小(dàxiǎo),利用具有网状结构的凝胶,来进行别离。1.概念(gàiniàn):〔分配色谱法〕第四页,共三十九页。3.凝胶色谱法别离蛋白质的具体(jùtǐ)过程第五页,共三十九页。第六页,共三十九页。4.凝胶色谱法的原理(yuánlǐ)①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动(yídòng)速度较慢;②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以别离。进行体外实验时,如何保证蛋白质不会发生(fāshēng)变性呢?第七页,共三十九页。〔二〕缓冲溶液(huǎnchōnɡrónɡyè)能够抵抗外界的酸和碱对溶液(róngyè)PH值的影响,维持PH根本不变。1.作用(zuòyòng):2.缓冲溶液的配制:
通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。3.在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,成分:磷酸二氢钠与磷酸氢二钠如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白?第八页,共三十九页。〔三〕电泳(diànyǒnɡ):1.概念(gàiniàn):带电粒子在电场(diànchǎng)作用下发生迁移的过程。2.原理:①许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的PH下,这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待别离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的别离。第九页,共三十九页。3.类型(lèixíng):琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。第十页,共三十九页。
聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定(cèdìng)蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠〔SDS〕—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺〔形成(xíngchéng)交联〕丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反响第十一页,共三十九页。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少(duōshǎo)以及分子的大小等因素。
1.原理(yuánlǐ):SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条(dāntiáo)肽链,因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。2.SDS作用机理:第十二页,共三十九页。用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定(cèdìng)蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时,可选用一组分子量的标准蛋白同时进行电泳(diànyǒnɡ),根据分子量的标准蛋白的电泳区带位置,可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。第十三页,共三十九页。第十四页,共三十九页。
二、实验(shíyàn)操作样品处理→粗别离→纯化→纯度(chúndù)鉴定蛋白质提取和别离(fēnlí)步骤血液血浆水分固体物质:血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞(最多)血红蛋白(90%)两个α-肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液有哪些成分?〔一〕血红蛋白第十五页,共三十九页。血红蛋白两个α-肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子(fēnzǐ)氧或一分子(fēnzǐ)二氧化碳,血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白(xuèhóngdànbái)的特点:第十六页,共三十九页。
用鸡的红细胞提取DNA,用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白(xuèhóngdànbái)的原因是什么?
鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取;人的红细胞无细胞核,结构简单(jiǎndān),血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。第十七页,共三十九页。(1)红细胞的洗涤(xǐdí):①洗涤(xǐdí)目的:去除杂蛋白,以利于后续血红蛋白的别离(fēnlí)纯化,洗涤次数不可过少。②洗涤操作:1、采集血样。2、低速短时间离心〔速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到别离的效果〕3、吸取血浆:上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤:用五倍体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心〔低速短时间〕6、重复4、5步骤三次,直至上清液中已没有黄色,说明洗涤干净。1.样品处理及粗别离〔二〕操作过程第十八页,共三十九页。(2)血红蛋白的释放:加蒸馏水到原血液体积(tǐjī),再加40%体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟〔加速细胞破裂〕,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)别离血红蛋白(xuèhóngdànbái)溶液:①过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次(céngcì):第1层〔最上层〕:甲苯层〔无色透明〕;第2层〔中上层〕:脂溶性物质沉淀层〔白色〕;第3层〔中下层〕:血红蛋白的水溶液层〔红色);第4层〔最下层〕:杂质沉淀层〔暗红色〕。③别离:用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。第十九页,共三十九页。(4)透析:①过程(guòchéng):取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中〔pH为7.0〕,透析12小时。②透析目的:除去样品中分子量较小的杂质。第二十页,共三十九页。2.凝胶色谱(sèpǔ)操作:〔1〕凝胶色谱(sèpǔ)柱的制作:①取长40厘米,内径1.6厘米的玻璃管,两端需用砂纸磨平。②底塞的制作:打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目尼龙纱包好,插到玻璃管的一端。本卷须知:底塞中插入的玻璃管的上部不得(bude)超出橡皮塞的凹穴底面,否那么难以铺实尼龙网,还会导致液体残留,蛋白质别离不彻底。③顶塞的制作:打孔→安装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。第二十一页,共三十九页。〔2〕凝胶色谱(sèpǔ)柱的装填①凝胶的选择:A、材料:交联葡聚糖凝胶〔G-75〕。B、代表意义:“G〞表示凝胶的交联程度,膨胀程度及别离范围。75表示凝胶的得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理(chǔlǐ):配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后,配成凝胶悬浮液。
第二十二页,共三十九页。③凝胶色谱柱的装填方法:A、固定:将色谱柱装置固定在支架上。B、装填:将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。注意:1、凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在:因为(yīnwèi)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低别离效果。〔2〕凝胶色谱(sèpǔ)柱的装填第二十三页,共三十九页。
④洗涤平衡:装填完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶,在50cm高的操作(cāozuò)压下,用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液〔pH为7.0〕充分洗涤平衡12小时。注意:1、液面不要低于凝胶外表,否那么可能有气泡混入,影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的别离效果。2、不能发生洗脱液流干,露出凝胶颗粒的现象。50cm高〔2〕凝胶色谱(sèpǔ)柱的装填第二十四页,共三十九页。〔3〕样品(yàngpǐn)参加与洗脱①调节(tiáojié)缓冲液面:翻开下端出口,使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。②滴加透析样品:吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端,滴加样品时,吸管管口贴着管壁环绕移动加样,同时注意不要破坏凝胶面。
第二十五页,共三十九页。注意:正确的加样操作(cāozuò)是:1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。第二十六页,共三十九页。③样品渗入凝胶床:加样后翻开下端出口,使样品渗入凝胶床内,等样品完全(wánquán)进入凝胶层后,关闭下端出口④洗脱:小心参加pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度,连接缓冲液洗脱瓶,翻开下端出口进行洗脱。⑤收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5ml收集一试管,连续收集。〔在别离过程中,如果红色区带均匀一致的移动,说明色谱柱制作成功〕第二十七页,共三十九页。思考(sīkǎo)下面的问题:让血红蛋白处在稳定(wěndìng)的pH范围内,维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理(chǔlǐ)的目的是什么?2、与其他蛋白质相比,血红蛋白有什么特点?这一特点对你进行血红蛋白的别离有什么启示?血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱别离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的别离过程非常直观,大大简化了实验操作。第二十八页,共三十九页。〔三〕SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳〔选做〕鉴定血红蛋白(xuèhóngdànbái)纯度。1.目的(mùdì):第二十九页,共三十九页。1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液(róngyè)2.样品的粗别离——经过透析去除分子量较小的杂质3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。小结:你能描述血红蛋白别离的完整(wánzhěng)过程吗?第三十页,共三十九页。观察你处理的血液样品离心后是否分层〔见教科书图5-18〕,如果分层不明显,可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外,离心速度过高和时间过长,会使白细胞和淋巴细胞一同(yītóng)沉淀,也得不到纯洁的红细胞,影响后续血红蛋白的提取纯度。三、结果分析(fēnxī)与评价
1、你是否(shìfǒu)完成了对血液样品的处理?你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗?第三十一页,共三十九页。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生?你的色谱柱装填得成功吗?你是如何(rúhé)判断的?由于凝胶是一种半透明的介质,因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯,检查凝胶是否装填得均匀。此外,还可以参加(jiārù)大分子的有色物质,例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖,观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整,说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡,轻轻敲打柱体以消除气泡,消除不了时要重新装柱。第三十二页,共三十九页。如果凝胶色谱柱装填得很成功、别离操作也正确的话,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明别离的效果(xiàoguǒ)不好,这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的别离(fēnlí)过程中红色区带的移动吗?请描述红色区带的移动情况,并据此判断别离(fēnlí)效果?第三十三页,共三十九页。作业(zuòyè)完成?血红蛋白的提取(tíqǔ)和别离?学案稳固1、稳固2、例1;随堂达标检测1、3;活页1、3、5、75月15日第三十四页,共三十九页。作业(zuòyè)完成(wánchéng)?血红蛋白的提取和别离?学案全部5月16日第三十五页,共三十九页。 教学(jiāoxué)反响1.凝胶色谱法是根据〔〕别离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2.缓冲液的作用是:在一定范围内,抵抗外界的影响来维持〔〕根本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3.电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷〔〕的电极(diànjí)移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的〔〕与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白BBBA第三十六页,共三十九页。5.血液由血浆和各种血细胞组成,其中〔〕的含量最多。A白细胞B血小板C红
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