3-基因工程的酶学基础

第二章基基因工程程的酶学基基础Enzymes1本章节内容容第一节限限制性核核酸内切酶酶第二节DNA连连接酶第三节DNA聚聚合酶第第四节DNA修修饰酶第第五节核核酸外切切酶第六节单单链核酸酸内切酶2本章学习内内容重点讨论限限制性核酸酸内切酶和和DNA连连接酶在DNA切割割和连接中中的应用，，并简要介介绍其他与与基因克隆隆有关的其其它的重要要的酶。3一、限制性性核酸内切切酶第一节限制性核酸酸内切酶是一类能够够识别双链DNA分子中的某某种特定核苷酸酸序列，并由此处处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease））42.性质质内切酶主要来源于于原核生物物即在核酸分分子链的内部制造切口的的酶。形成5’-P和3’’-OH末末端自我保护作作用3.功能能细菌的限制制和修饰系系统（R/M体系））1.来源源56限制性内切切酶将侵入入细菌体内内的外源DNA进行分解解，切成小片断断。（1）限制制（Restriction）7细菌自身的的DNA碱碱基被甲基化酶甲基化修饰饰所保护，，不能被自自身的限制制性内切酶酶识别切割割。（2）修饰饰（Modification）①Dam甲基化酶酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺腺嘌呤呤N6位位置引入入甲基②Dcm甲基基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或或CCTGG序序列在第第二个C上C5位置上引引入甲基基89（3）限限制与修修饰系统统相关的的三个基基因①hsdR:编编码限制制性内切切酶②hsdM:编编码限制制性甲基基化酶③hsdS:编编码限制制性内切切酶和甲甲基化酶酶的协同同表达这类酶能能识别DNA分分子上的的特定位位点，并并将双链链DNA切断这类酶使使DNA分子特特定位点点上的碱碱基甲基基化，即即起修饰饰DNA的作作用。作用是协协同上述述两种酶酶识别特特殊的作作用位点点。101973年H.OSmith和D.Nathans提议的的命名系系统，命命名原则则如下：：二、限制制性内切切酶的命命名用属名的第一个个字母和和种名的头两个个字母组组成3个个字母的的略语表表示寄主菌的物种名名，组成成酶的基基本名称称。大肠杆菌菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示112.如果酶存存在于一一种特殊的菌菌株中，则将将该菌株株名的第第一个字字母加在在基本名名称后，，若酶的的编码基基因位于于噬菌体（（病毒））或质粒粒上，则用用一个大大写字母母表示此此染色体体外遗传传成分。。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗抗药性R质粒123.如果一种种特殊的的菌株内内有几种种不同的的限制与与修复系系统，用用罗马字字母表示示该菌株株中发现现某种酶酶的先后次序序。如HindⅡ：d菌株株中发现现的第二二个酶4.所有的限限制酶，，除以上上名称外外还要冠冠以系统名称称。限制性性内切酶酶的系统统命名为为R，甲甲基化酶酶为M。。如R.HindⅢ表示限制性性内切酶M.HindⅢ表示示相应的甲基基化酶实际应用中，，R常被省略略。13Ⅰ型限制性性内切酶目前鉴定出四种不同类型型的限制性内切切酶。主要的的三种：三、限制性内内切酶的类型型Ⅱ型限制性性内切酶Ⅲ型限制性性内切酶14首先由M.Meselson和R.Yuan在在1968年年从大肠杆菌菌B株和K株分离的。（1）识别位位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.Ⅰ型限制性内切切酶的基本特特性如EcoB和EcoK。未甲基化修饰饰的特异序列列。15需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫硫氨酸）（3）辅助因子在距离特异性性识别位点约约1000—1500bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点16首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在在1970年年从流感嗜血血菌中分离出出来。（1）识别位位点序列未甲基化修饰饰的双链DNA上的特殊靶序序列（多数是是呈典型的旋转对称型的的回文结构）。与DNA的的来源源无关关，即即没有种种的特特异性性。2.Ⅱ类限限制性性内切切酶的的基本本特性性分离的的第一一个酶酶是HindⅡⅡ基因工工程用用途最最大17稀有切切割限限制酶酶（rarecutter）可以识识别6个以以上的的核苷苷酸序序列的的少数数的限限制内内切酶酶。如NotI（GCGGCCGC）某些限限制性性内切切酶的的识别别序列列中，，某一一个或或两个个碱基基并非非严格格专一一。如HindⅡⅡ可识识别4种核核苷酸酸序列列：Y:C或TR:A或或GGTYRAC-3’’5’-18EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（2））切割位位点切开双链DNA，形形成粘性末末端（stickyend）或或平齐末末端（bluntend））。如如：识别位位点处处19含有几几个核核苷酸酸单链的末端端。分两种种类型型：GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’’3’--5’’5’--3’’3’--5’’[1]粘粘性末末端（stickyends，cohensiveends））ⅰ）5’’端凸凸出（（如EcoRI切点点）20CTGCAGGACGTC5’--3’’3’--5’’5’--3’’3’--5’’CTGCAGGACGTCⅱ）3’’端凸凸出（（如PstI切点点）21i）不同的DNA双双链：只要粘性性末端碱碱基互补补就可以以连接。。ii）同一个DNA分分子内连连接：通过两个个相同的的粘性末末端可以以连接成成环形分子子。这比连接接两个平平齐末端端容易得得多。[2]粘粘性末末端的意意义①连接便利利2223B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚聚核苷酸的尾尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性性末端。A末端可用DNA多核苷酸激酶酶进行32P标记。粘性末端可以以用DNA聚聚合酶补平成成平齐末端。。②末端标记记③补平成平平齐末端24[3]平齐齐末端（bluntend）在识别序列的的对称轴上同时切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV25[4]平齐齐末端的特点点连接困难，连接效率低，只有粘性末末端连接效率率的1%，这这种连接常出出现多联体连接。粘性末端与平平齐末端连接接的处理方法法ⅰ）添补法：：利用DNA聚合酶酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到到目的基因的的粘性末端上上。26ⅱ）削除(平平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘粘性末端的单单链突出部分分削去，使其其成为平齐末末端27不同来源的酶酶，识别相同的序序列，切割方式相同同或不同。识别位点和切切点完全相同同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：：28XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同同，但切点不不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶酶：29识别的序列不不同，但能切出相同的粘粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；；Y代表嘧啶啶。[6]同尾尾酶(Isocaudamers））305’-GATC----3’’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性性末端互相结结合后形成的的新位点一般不能再被原来的酶酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A31限制性内切酶酶的识别和酶酶切活性一般般在一定的温度、离子强强度、pH等条件下才表表现最佳切割割能力和位点点的专一性。。如果改变反应应条件就会影影响酶的专一性和切割割效率，称为星号（（*）活性。。所以一般使用用专一的反应应缓冲液。[7]限限制酶的酶酶活性①星号（（*）活性性32EcoRI和BamHI等都都有*活性性。在低盐、高高pH（>8）时可可识别和切切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoRI：：使用用的的时时候候要要特特别别注注意意！！733②诱诱发发星星号号（（*））活活性性的的原原因因ⅰ））高高甘甘油油含含量量ⅱ））内内切切酶酶用用量量过过大大ⅲ））低低离离子子强强度度ⅳ））高高pHⅴ））含含有有机机溶溶剂剂，，如如乙乙醇醇ⅵ））Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二二价价阳阳离离子子的的存存在在酶量量不不宜宜过过多多，，尽尽量量遵遵循循生生产产商商推推荐荐的的反反应应条条件件34在离离它它的的不对对称称识识别别位位点点一侧侧的的特定定距距离离处切切割割DNA双双链链。。移动动切切割割（（shiftedcleavage):GACGCNNNNNHgaICTGCGNNNNNNNNNN5’3’[8]Ⅱs型型限制性内切切酶35（3）Ⅱ型限制性内内切酶不具有有甲基化功能能Ⅱ型酶的甲基化化修饰活性由由相应的甲基基化酶承担。。它们识别相同的DNA序列列，但功能不同。如EcoRI限制性性内切酶和EcoRI甲基化化酶前者：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’3’-CTT*AAG-5作用的位点也也不相同36（4）II型限制性内切切酶对单链DNA的切割割定义为为切割割双链链DNA，，但有有一些些还可可以特特异识识别并并切割割单链链DNA的的相应应位点点，只只是切割效率比比较低如：HhaⅠ切割单链DNA比切割双链DNA效率率低50％％373.Ⅲ类限制性性内切酶在完全肯定定的位点切切割DNA，但反应应需要ATP、Mg2+和SAM（（S-腺苷苷蛋氨酸））。在基因工程程操作中用用途不大。。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG38核酸限制制性内切切酶的特性

Ⅰ类内切酶Ⅱ类内切酶Ⅲ类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（Ⅱs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG39切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3’端24－26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用处不大40四、限制制性内切切酶酶解解反应条条件1.标标准酶解解体系的的建立一个单位位（U））的限制制性内切切酶定义义：在合适的的温度和和缓冲液液中，在在20μl的反反应体系系中，1h完全全酶解1μgDNA所所需要的的酶量。。推荐：稍稍过量的的酶（2-5倍倍）和较较长的反反应时间间412.酶酶解过程程配酶解体体系混匀反应终止止酶解结果果鉴定42①酶解解体系一般20μl，保证酶酶液体积不超超过反应总体体积的10%前提下，尽尽量降低反应应总体积。加样顺序一般般是：ddH2ObufferDNA酶酶43大部分分II型型核酸酸内切切酶需需要相相似的的反应应条件件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr44②混混匀移液枪枪吹打打或手指轻轻弹管管壁若底物物分子子很大大（如如基因因组DNA），，应避避免强强烈振振荡。。混匀后后微量量高速速离心心机进进行短短暂离心心，使使管壁壁液体体全部部下沉沉。45③反反应应终终止止三种种方方法法：：ⅰ））加加乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸（（EDTA）至至终终浓浓度度10mmol/L;加加十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（（SDS）至终浓度度0.1%(W/V)ⅱ）65℃加热20min或者者70℃℃加热10minⅲ）酚/氯仿抽提46④酶解解结果鉴鉴定快速进行行微型琼琼脂糖凝凝胶电泳泳观察然后决定定是否终终止反应应47酶切后发发现除了了目的DNA条条带外，，还有其其它条带带酶存在““星号””活性，，造成非非特异性性切割；；不正确的的操作，，导致其其它内切切酶污染染；底物DNA中可可能存在在其它DNA污污染。电泳后电电泳条带带扩散，，电泳条条带移动动距离异异常底物DNA不纯纯；内切酶不不纯；酶蛋白自自身或其其它杂蛋蛋白与DNA结结合在一一起使电电泳条带带移动距距离异常常483.限限制性内内切酶对对DNA分子的的消化1986年J.A.McClarin等等通过X射线晶晶体衍射射发现Ⅱ型限制酶酶是以同型二聚聚体的形式与与靶序列列结合。。CTTAAGGAATTC（1）内内切酶与与识别序序列的结结合模式式49内切酶在在DNA上的所有识别位点点都被切切开12341234（2））完完全消消化50只有有有限数数量的的酶切切位点点被切切开通过缩缩短保保温时时间、、降低低反应应温度度、增增大反反应体体积或或减少少酶量量可达达到局局部消消化的的目的的。123414（3））局局部消消化51（4））几几种常常用限限制酶酶识别别位点点5253AATTACGTAGCTATATCATGCCGG********MaeIIHpaⅡcMspIc

****AluI****A****TNlaⅢA****TApoI

HindⅢAflIII

AgeIBsrFIA****TA****TSspIA****T（5））限制制性内内切酶酶识别别序列列的交交叉列列表54AATTACGTAGCTATATCATGCCGGA****TNsp7524C****GNcoIStyIDsaI

XmaIAvaIC****GNdeIC****GPmlIBsaAIPvuIINspBII

SmaIC****GC****GG****CEcoRIApoINgoMIBsrFI55AATTACGTAGCTATATCATGCCGGG****CBseHIG****CEcl136IIEcoRV

NaeIG****CG****CAatIISacIBanIIHgiAIBsp1286

SphINsp7524T****ABspHIBspMIIT****AT****ASnaBIBsaAI

T****AT****A56CGCGCTAGGATCGCGCGGCC****MboIcSau3AIc

****BfaIHinpI****BstUIDpnIHaeIII****HhaIA****TA****TMluIAflIIISpeIBglIIBstYIA****TA****TEco47IIIStuIA****T

57CGCGCTAGGATCGCGCGGCCA****THaeIIC****GDsaIAvrIIStyIEagIEaeIGdiII

C****GC****GNspBIIC****GSacIIPvuIC****GBsiEIBsiEIG****CBssHIINheIBamHIBstYIKasIBanIBsp120I58CGCGCTAGGATCGCGCGGCCG****CNarIBsaHIG****CG****CG****CT****ABbeIHaeIIApaIBanIIBsp1286

T****AXbaIBclIEaeIT****ANruIFspIMscIT****AT****A59GTACTATATCGATGCATTAA********Csp61TaqIMseI****RsaI****A****TA****TA****TClaIAseIA****TScaIA****T60GTACTATATCGATGCATTAAA****TNsiIC****GBsiWISfcIXhoIAvaIAvaISfcIC****GC****GC****GC****GPstIG****CAsp718BanISalIApaLI61GTACTATATCGATGCATTAAG****CAccIAccI

G****CBsrl107IHincIIHpaIHincIIG****CG****CKpnIBsp1286HgiAIT****AT****ABstBIT****ADraIT****AT****A624.限限制制性内内切酶酶酶解解反应应中的的注意意事项项①大大多数数厂家家供应应的限限制内内切酶酶为浓浓缩液液1U的的酶液液足以以在1h内内消化化10μgDNA，酶和和底物物比例例2-10U/ugDNA,避避免使使用过过高的的酶浓浓度②浓缩液液使用前可可用1×限限制酶缓冲冲液稀释③限制性性内切酶在在含50%的甘油的的缓冲液中中，于-20℃稳稳定保存63④酶分装装成小份，，避免反复复冻融⑤反应中中尽可能少少加水，使使反应体积积减到最低低⑥通常增增加反应时时间，可降降低酶量64DNA中的的杂质如蛋白质、酚酚、氯仿、、乙醇、SDS、EDTA等都会影响响酶的活性性。1.DNA的纯度度五、影响限限制性内切切酶活性的的因素①纯化DNA②加大酶的的用量，1ugDNA用10U酶③延长保温温时间④扩大反应应体积（>20l）一般采取65需要合适的的底物：底物（DNA）纯度度要高.不不能含有RNA和蛋蛋白质;也也不能含有有过高的EDTA。。更不能含含有酚、氯氯仿、乙醇醇、SDS和其他有有机试剂。。DNA的的浓浓度度不宜宜过过高高，，高高浓浓度度的的DNA会会使使溶溶液液的的粘粘度度增增加加从从而而抑抑制制酶酶分分子子的的扩扩散散导导致致酶酶切切反反应应不不彻彻底底。。常常为为50ul内内含含1ugDNA。。66大肠肠杆杆菌菌一一般般有有两种种甲甲基基化化酶酶修饰饰质质粒粒：：2.DNA的的甲甲基基化化程程度度DNA腺腺嘌嘌呤呤甲甲基基化化酶酶（DNAadeninemethylas,dam)（（修修饰饰GATC中中的的A）；；DNA胞胞嘧嘧啶啶甲甲基基化化酶酶（DNAcytosineethylas,dcm)（（修修饰饰CCA/TGG的的C）。基因工程中必必须使用甲基基化酶失活突突变的菌株。。67不同的限制性性内切酶的最最适反应温度度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。每微克DNA用1～5单单位的酶，保保温1~2小小时。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度68是影响限制酶酶活性的重要要因素4.缓冲液液(Buffer)（1）缓冲液液的化学组成成MgCl2、NaCl/KCl：提提供Mg2+和离子强度Tris-HCl：维维持pH,大多数为为7-7.6二硫苏糖醇（（DTT）：：防防止酶氧化,保持酶稳定定性牛血清白蛋白白（BSA））等：中性蛋蛋白质,防止止酶在低浓度的蛋白质质溶液中变性性商品化的限制制酶一般都带带有专用缓冲冲液69（2）两种或或两种以上的的酶切割DNA样品①在相同的的缓冲液中反反应同时进行行②若需要不不同的缓冲液液,采用3种种方法ⅰ)先用要求求低离子强度的酶酶切割（低盐盐酶）,再加加NaCl调调节离子强度,并并用第二种酶酶切割（高盐盐酶）；ⅱ)先用一种酶切割,然后后用2.5倍倍体积的乙醇醇沉淀酶解产产物,再重悬于另一一种缓冲液中中进行第二种种酶切割；ⅲ)使用所有有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸钾buffer),经适当当稀释可达到到各种限制性性酶要求的buffer条件。70练习题何为限制性内内切酶？有哪哪些类型，各各有什么作用用和特点什么是限制性性内切酶的星星号活性？受受哪些因素影影响？限制性核酸内内切酶是由细细菌产生的，，其生理意义义是【】】

Ａ修修复自身的遗遗传缺陷ＢＢ促进自自身的基因重重组

Ｃ强强化自身的的核酸代谢ＤＤ提高高自身的防御御能力ＥＥ补充自身身的核苷酸消消耗71从细菌DNA环化现象推推测，必定存存在一种能把把两条DNA双链连接到到一起的酶。。第二节DNA连接接酶一、DNA连连接酶（ligase)的发现DNA复制一一定有断口72DNA连接酶酶:一种能够催化化在两条DNA链之间形形成磷酸二酯键的酶1967年，，世界上数个个实验室几乎乎同时发现了了一种能够催催化在2条DNA链之间间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。。73（1）大肠杆杆菌连接酶1.两种共共价连接DNA限制片段段的DNA连连接酶只能连接粘性末端，背背景低，准确确性高二、DNAligase的特点（2）T4噬噬菌体的连接接酶不但能连接粘粘性末端；还还能连接齐平末端74（1）必须是是两条双链DNA（2）DNA3’端有游游离的-OH，5’端有一个个磷酸基团（（P）（3）需要能量动物或噬菌体体中：ATP大肠杆菌中：：NAD+2.连接条条件75（4）DNA连接酶的反反应条件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1UDNA连接酶的的酶活性：在在最佳反应条条件下15℃反应1小小时，完全连连接1mgl-DNA（HindⅢ片段）所需的的酶量。761.ATP（NAD+)提供激活的的AMP。三、连接反应应的机理2.AMP与连接酶形形成共价“连接酶-AMP”复合物，并并释放出焦磷磷酸PPi（（NMN））。3.AMP与连接酶的的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi774.AMP随后从连接酶酶的赖氨酸-氨基转移移到DNA一一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP785.3’-OH对磷原子作亲亲核攻击，形形成磷酸二酯酯键，释放出出AMP。79如何连接由限限制性内切酶酶切割形成片片断的末端？80连接酶反应的的最佳温度是是37C。四、连接反应应的温度1.最佳温温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳稳定。2.实用温温度所以一般采用用4~16C81增加插入片段段与载体的接接触机会，减减少同一个分分子末端自我我连接的现象象。1.DNA末端的浓度度五、影响连接接反应的因素素10~20倍倍2.插入片片段与载体的的浓度比例两种构型：线线状分子和环环状分子与DNA浓度及DNA分子长长度相关823.反应温温度黏性末端：12～16℃℃平头末端：10～20℃℃4.ATP浓度一般，ATP最适的终浓浓度为0.5mmol/L.ATP浓度高高至5mmol/L，影影响平头末端端的连接ATP浓浓度高至至7.5mmol/L，抑制制粘性末末端及平平头末端端的连接接。83六、DNA连接接的反应应体系酶切纯化化后的DNA片片断连接缓冲冲液DNA连连接酶84从分子动动力学的的角度讲讲，由限限制性核核酸内切切酶创造造的粘性性末端的的连接属属于分子子内部的的连接，，而平头头末端的的连接则则属于分分子间的的连接，，因此后后者反应应速度要要慢得多多。七、平头双链链DNA片段的的连接操操作85加大连接接酶用量量（10倍大于粘粘性末端端的连接接）加大平头头末端底底物的浓浓度，增增加分子子间碰撞撞机会加入10%PEG8000，促进大大分子之之间的有有效作用用加入单价价阳离子子（NaCl），最终终浓度150-200mM提高平头头末端连连接效率率的方法法包括：：86第三节DNA聚合合酶DNA聚聚合酶（（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下下，把脱脱氧核糖糖多核苷苷酸连续续地加到到双链DNA分子子引物链的的3’－OH末端端，催化化核苷酸酸的聚合合作用.87一、基因因工程中中常用的的DNA聚合酶酶大肠杆菌菌DNA聚合酶酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚聚合酶4.T4DNA聚聚合酶5.修修饰过的的T7DNA聚合酶酶6.逆逆转录酶酶7.TaqDNA聚聚合酶881.共共同特点点把dNTPs连连续地加加到引物物的3’’－OH端2.主主要区别别T7DNA聚聚合酶可以连续续添加数数千个dNTPs而不不从模板板上掉下下来。其它几种种DNA聚合酶酶只能连连续添加加10多多个dNTPs就会从从模板上上解离下下来。二、常用用的DNA聚合合酶的特特点持续合成成能力和和外切酶酶活性不不同。89DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常常用DNA聚合合酶的特特性比较较90三、DNA聚合合酶在在基因因工程程中的的用途途1.大大肠肠杆菌菌DNA聚聚合酶酶ⅠⅠ主要用用来制制备带带放射射性标标记的的DNA探探针（（32P标记记）。。（1））大肠肠杆菌菌DNA聚聚合酶酶Ⅰ的的性质质①一条条单链多多肽②5’’3’外外切酶酶活性性位于于N端端③用枯草杆杆菌蛋蛋白酶酶处理可可以切切掉N端的的5’3’外外切酶酶活性性部分,就成成为Klenowfragment。91①底底物：：dNTPs（dATP、、dGTP、dCTP、、dTTP）②Mg2+③带有3’-OH游离端的的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶酶I（PolI））的反应条条件-OH5’3’dNTPs92标记①核酸酸探针（（probe））能够同某某种被研研究的核核酸序列列特异性性结合的的，带有有标记的的寡聚核核酸分子子。（3）用用DNA聚合酶酶Ⅰ制备探探针已知序列列的核酸酸片断显示位置置与互补的的待测序序列杂交交93标记已知序列列的核酸酸片断②探针针的标记记方式标记已知序列列的核酸酸片断带有放射射性的已已知序列列的核酸酸片断5’3’94③DNA聚合合酶I对对探针针序列的的标记切口平移移法(nicktranslation)：：放射性同同位素标标记：当存在dNTP时，DNA聚聚合酶I同同时具备备5’3’外外切酶活性和5’3’的的聚合酶酶活性。955’3’外外切酶活活性从DNA缺缺口的下一段DNA5’端除除去一个个核苷酸酸后，聚聚合酶活活性就会会在缺口口的上一段DNA的的3’一一侧补上上一个新新的核苷苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’96纯化的DNA片片断DNaseI制造单单链缺口口DNAPolI进进行切口口转移一种-32P-dNTP和和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP从头至尾尾都被标标记972.Klenowfragment具有5’’3’聚合合酶活性性和3’’5’外切酶活活性。（失去了5’3’外切酶活活性）。（1）Klenowfragment的性质质DNAPolIKlenowfragment(76KD））枯草杆菌蛋白白酶98①3’端补补平5’5’klenow②DNA3’末端标标记补平限制性内内切酶切后形形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标标记的dNTP。klenow（2）主要用用途993’隐蔽末端端的DNA片片断Klenowfragment补补平根据末端的顺顺序选择一种种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’’5’’----G3’’3’’----CCTAG5’’5’’----GG3’3’----CCTAG5’’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h100③cDNA第第二链的的合成mRNAcDNA第一链链逆转录cDNA第二链链klenow5’3’3’5’5’3’引物101（1）T4DNA聚合酶酶的性质质3.T4DNA聚聚合酶从T4噬噬菌体感感染后的的大肠杆杆菌培养养物中分分离纯化化，由噬菌体基基因43编码。有5’3’聚合合酶活性性和3’’5’外切切酶活性性（降解解单链更更快）。。①来源源②酶活活性102③特点点A当没没有dNTP时时，T4DNA聚合合酶行使使3’5’外切切酶功能能，制造出3’隐蔽蔽端。B如果果只有一一种dNTP，，则降解解到该dNTP的位置置。C在四四种dNTP均均存在时时，聚合合活性占占主导地地位。1035’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚聚合酶无dNTPsT4DNA聚聚合酶有dNTPs5’5’104（2）T4DNA聚合酶酶的用途途标记末端端（取代代合成法法或置换换合成法法）用3’5’外外切酶活活性作用用于所有末端端形式的的3’端端（平端、、3’隐蔽蔽端、5’隐蔽蔽端）制制造出3’隐蔽蔽端。再利用它它的5’’3’聚聚合酶活活性补平平，并加加入放射射性标记记的dNTP。。①补平平隐蔽末末端②DNA3’末端端标记105酶切中间间产生两两个末端端标记加入某种种32P-dNTP和和dNTPsT4DNA聚聚合酶（3’5’外外切）DNA酶酶切片断断T4DNA聚聚合酶（5’3’聚聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切切无dNTPs106a.放射性性标记的优缺点：制作简单高比放射性放射自显影效效果好优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存对人体有害要求在专门实实验室操作107b.非放射射性标记i）生物素标标记生物素（biotin）），又称维生生素H、辅酶酶R可以与dNTP酰化结合合成为biotin-1,6-dUTP、biotin-1,4-dATP、biotin-1,1-dUTP等。。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物物素连接酶（（biotinligase）催催化与蛋白质质共价结合。。108纯化的DNA片断DNaseI制造单单链缺口DNAPolI进进行缺口转移移biotin-dTTP和和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用切口转移移法将生物素素掺入DNA探针中109ii）地高辛辛标记：可以与dNTP连接成地地高辛-dUTP等，参参入DNA合合成过程，形形成地高辛标标记的DNA探针。生物素和地高高辛标记的探探针都有商品品化的试剂盒盒(kit)。地高辛的结合合物是抗地高辛抗体体。1104.T7DNA聚合合酶（1）来源从T7噬菌体体感染大肠杆杆菌细胞中纯纯化出来的，，由两个亚基基组成：①T7噬菌菌体基因5编编码的大亚基基：T7噬菌体5蛋白。有5’3’聚合酶和和3’5’外切酶活活性。②大肠杆菌菌编码的小亚亚基：硫氧还蛋白。。增加大亚基对对模板的亲和性性。111（2）T7DNA聚合合酶的特点①持续合成成能力强一旦与模板结结合就会不间间断地合成互互补链。②3’5’外切酶活活性高单链和双链都都能降解。③不受DNA二级结构构的影响其它DNA聚聚合酶受DNA二级结构构的阻碍112②进行末端端标记①催化大分分子量DNA为模板的合合成如M13噬菌菌体③补平隐蔽蔽末端（3）T7DNA聚合合酶的用途合成补平3’隐蔽蔽末端；水解修平3’突出出末端。1135.修饰后后的T7DNA聚合酶酶（1）T7DNA聚合酶酶的化学修饰饰去除3’5’外切酶活活性，使DNA聚合能力力和聚合速率率提高了3倍倍。（2）修饰后后的T7DNA聚合酶酶的用途①DNA测测序双脱氧法。②标记DNA3’隐隐蔽末端③更有效地地补平末端1146.逆转录录酶最普遍使用的的是来源于鸟类骨髓母细细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依赖RNA的的DNA聚合合酶（RNA指导的DNA聚合酶））。（1）来源RNA肿瘤病病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组组成，最适反反应温度为41～45℃115①链有反转录活性性和RNaseH活性。RNaseH：以5’3’’或3’5’方向特异异地水解RNA-DNA杂交双链中中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA116（3）逆转录录酶的用途②链RNA-DNA杂交交双链中5’3’DNA外切酶活性性。①合成cDNA以oligodT为引物（（与mRNA的polyA尾尾巴互补结结合）。AAAAATTTTT5’’3’’mRNA5’’cDNA117②合合成成DNA探探针针用随随机机引引物物（（randomprimer））或或oligodT做做引引物物。。随机机引引物物：：随机顺序形成成的寡聚DNA片断。（理论上它能能与各种序列列的模板结合合）118第四节DNA修饰饰酶一、末端脱氧氧核苷酸转移移酶1.来源小牛胸腺。2.组成大小两个亚基基。3.特性5’3’DNA聚聚合酶活性（terminaltransferase）119②不需要模板！①需要3’’—OH、二二甲胂酸缓冲冲液。③底物可以以是单链DNA、是3’’—OH突出出的双链DNA、平末端需Co2+激活，但反应应效率低。④随机添加加的dNTPs。如果只有一种种dNTP，，就添加上同聚物。DNA5’’3’TTTdTTP，，末端转移酶酶1204.末端转转移酶的用途途（1）同聚物物加尾给外源DNA片片断和载体分子分别加上上互补的同聚聚物尾巴，以以使它们有效效地连接。外源DNA载体DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶121（2）再生酶酶切位点便于回收克隆隆片断。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow补平122AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA123（3）DNA3’－OH末端标记AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位点HindⅢ位点连接催化非放射性或放放射性标记物掺入DNA片断的的3’端。（生物素-11-dUTP等）124二、T4多核核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的的pseT基因编码。。从T4感染染大肠杆菌细细胞中分离出出来。多种哺乳动物物细胞中也发发现这种酶。。2.功能其激酶活性位于N－端附附近，磷酸酶活性位于C－端附附近。催化-磷酸从ATP转给双链或或单链DNA或RNA的的5’-OH端。不论5’-OH端突出与与否。1255’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸酸激酶如果ATP的的-磷酸带有32P标记，就可可见被转移到到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端端都是磷酸化化的。1263.多核苷苷酸激酶的用用途DNA5’-OH端磷磷酸化化、标标记DNA的5’端端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷苷酸激激酶3’P--OH5’3’HO--P5’碱性磷磷酸酶酶（1））正向向反应应（forwardreaction））127（2））交换换反应应标记记法反应混混合物物中具具有超超量(-32P)ATP和ADP时，，多核核苷酸酸激酶酶能催催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端端的磷磷酸交换。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激激酶反应效果不不理想。128三、碱性磷磷酸酶1.碱性性磷酸酶种种类从大肠杆菌菌中分离出出来。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌菌性碱性磷磷酸酶（2）小牛牛肠碱性磷磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中中纯化出来来。具有抗热性性。SDS中加加热68oC可完全失失活。1292.碱性性磷酸酶的的特性催化脱掉DNA（或或RNA））5’端的磷磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶酶3.碱性性磷酸酶的的功能（1）防止止线性化的的载体份子子自我连接接130单一酶切口口的载体的的粘性末端端容易自我我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶酶5’5’