1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量报告

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量实验目的1、了解电泳技术的主要内容2、掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理与实验操作技术3、学会用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法测定蛋白质的相对分子量实验原理聚丙烯酰胺凝胶是一种多孔凝胶可用来检测蛋白质混合样品，主要是根据蛋白组分的分子大小和形状以及所带静电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差异。在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS),与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时蛋白质分子的迁移率主要取决于其相对分子质量,而与蛋白质自身形状及所带电荷无关。蛋白质的分子量与电泳迁被率间的关系，可用下式表示：MW=K(10-bm)(1)IgMW=lgk-bmR=Kl-bmR(2)式中MW为蛋白质分子量,K、K1为常数,b为斜率,mR为相对迁移率。将相对分子量的标准蛋白的迁移率对其分子量的对数作图，可得到一条标准曲线，根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。实验材料与用品1、材料:牛血清白蛋白、低分子量标准蛋白(14.4~94.0kD)、吸水纸、浮漂2、试剂：丙稀酰胺、10%十二烷基硫酸钠(SDS)、IMpH6.8的Tris-HCI缓冲液、1.5MPH8.8的Tris-HCI缓冲液、10%过硫酸镂、TEMED(N,N,N,N'-四甲基乙二胺)、Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mMTris.250inM甘氨酸(pH8.3)、0.1%SDS).染色液(0.1%考马斯亮蓝R-250、40%甲醇、10%冰醋酸)、脱色液(10%甲醇、10%冰醋酸)、3、仪器：电泳仪，电泳槽装置、脱色摇床、移液器、恒温水浴、15cm培养皿、枪头、1.5ml离心管。实验步骤组装玻璃板玻璃洗净,最后用双蒸水冲洗、吹干安装在制胶架上2、SDS聚丙稀酰氨凝胶的灌制(1)依顺序加入各组分配制别离胶溶液。注意一旦加入TEMED,马上开始聚合，故应快速操作。3%别离胶溶液的配制：溶液成分总体积10mL、双蒸水2.97mL、30%g丙稀酰胺4.33mL>1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸胺0.1mL、TEMED0.004mL(2)在玻璃板的间隙中灌注配制好的别离胶液,留出灌注浓缩胶所需的空间，即在胶面上小心注入一层双蒸水(约2〜3mm)高，以阻止氧气进入凝胶溶液。⑶待别离胶聚合完全后，倾出覆盖水层,再用滤纸吸净残留水。(4)依顺序加入制备浓缩胶。4%浓缩胶溶液的配制：溶液成分总体积5mL、双蒸水3.56mL、30%g丙稀酰胺0.67mL、1.5Mtris-HCl(pH6.8)0.63mL、10%SDS0.05mL、10%过硫酸胺0.05mL、TEMED0.005mL(5)在聚合的别离胶上直接灌注浓缩胶，至短玻璃板上缘l~2mm处，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心防止混入气泡,再加入浓缩溶液以充满梳子之间的空隙,将凝胶垂直放置于室温下。(6)等待浓缩胶聚合时，可同时对样品进行处理。以使蛋白质变性。在样品中按1:1体积比加入样品处理液,在100℃沸水浴中保温3min,取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可放入-20℃冰箱长时间保存，使用前需在100℃沸水中重新加热3min,以除去亚稳态聚合。3、装槽:浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，注意胶板上短玻璃一面口朝向负极(黑色)，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲、液。设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。4、上样电泳在制备浓缩胶后,不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境,如需要电泳只能在别离胶聚合后,并用别离胶缓冲液进行。预电泳后将别离胶面冲洗干净,然后才能制备浓缩胶。(1)按预定顺序用微量进样器加样,加样量通常为10〜20LiLo(2)将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为60V/cmo当染料前沿进入别离胶后，把电压调到120V/cm,继续电泳直至滨酚蓝到达别离胶底部上方约1cm然后关闭电源。(3)从电泳装置上卸下玻璃板,用刮刀勺撬开玻璃。在面对短玻璃板紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。5、染色和脱色染色时间:60min(视情况而定)，时间到后倒掉染色液，用去离子水冲洗2次终止染色，将胶块置于脱色液中。脱色需1〜2小时，期间应屡次更换脱色液直至蛋白质带与背景清晰。脱色后，可将凝胶浸于水中,长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。6、结果与分析(1)绘制标准曲线将大培养皿放在一张坐标纸上,量出加样端距前沿染料中心的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm),计算相对迁移率并绘制标准曲线，以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图,可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。考前须知1、在不连续电泳体系中，预电泳只能在别离胶聚合后进行。洗净胶面后才制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。2、电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。3、SDS纯度:在SDS中，需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。4、用SDS处理蛋白质样品时,每次都会在沸水溶中保温3〜5min,以免有57亚稳聚合物存在。5、标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2〜0.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时,都应同时用标准蛋白制备标准曲线,而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量,而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围,最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好,对糖蛋白,胶原蛋白等分子量测定差异较大。6、对样品的要求:应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，那么应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10〜1511L为宜,如样品系较稀的液体状,为保证区带清晰,加样量可增加，同时应将样品溶解液浓