实验四感受态细胞的制备和连接产物的转化

实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化一、实验原理与目的学习CaCl法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；2掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。用CaCl处2理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。二、材料与试剂O.lmol/LCaCl2溶液:称取0.56gCaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml,高压灭菌。含15%甘油的O.lmol/LCaCl2:称取0.56gCaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml,高压灭菌。1.5mlEP管、灭菌枪头、移液枪、冰盒、低温离心机、涂布棒、大肠杆菌DH5a、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、氨苄青霉素三、实验方法1、 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl法）21） 取-70°C超低温冰箱保存的大肠杆菌DH5a菌液30卩1（过夜菌液约16小时）接种于3mlLB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过夜。2） 将过夜培养的菌液1ml移入100mlLB培养基中，37C快速振荡（250rpm）,至OD=0.4—0.6（约2小时）；冰上30min。3） 取10ml培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4C下4000g离心10分钟。4） 弃去上清，用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后,4C下4000g离心10分钟。5） 弃去上清，加入2ml预冷的含20%甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬，即成感受态细胞悬液。6） 感受态细胞分装成200卩1的小份，贮存于-70C可保存半年。每组做好标记，每组分装10管即可。2、 转化大肠杆菌感受态细胞1） 取上述方法制备的感受态细胞，或者从-70C超低温冰箱取出一管感受态细胞融化。2） 按每200卩1菌液加100ng已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将lOylDNA连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30min。3） 42C水浴中热激90sec，迅速取出立即放于冰上2min。注意：在水浴中切勿乱晃动。4） 上述管中加入800y137C预热的LB培养基至总体积为1ml,混匀后37C180rpm培养1-2小时左右复苏。5） 4000rpm离心10min，去800yl上清液，将剩余的200y1菌液混匀。6） 用烧烤过的涂布将100卩1的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB固体培养基，涂匀，置于超净台上1小时左右至菌液完全被培养基吸收。7） 37C倒置培养12-24小时。从平板上挑选抗性菌落进行鉴定。

四、主意事项1、 为了提高转化效率活细胞数务必少于108个/ml,即OD值为0.4左右，为了确保生长浓度不会太高，可每隔15-20min进行一次OD值监测。2、 热激是一个非常重要的步骤，应准确的达到热激所需要的温度的时间。3、 如果加入太多的菌落裂解液，会改变了反应混合液的离子平衡，导致实验失败。4、 PCR扩增对DNA模板的要求量很低，因而在利用菌落裂解液作为模板时，应避免加入过量的模板DNA样品。5、 偶尔带入琼脂碎片于反应混合液中，会抑制的热稳定性DNA聚合酶的扩增。菌落PCR结果:g1011121314151617IS1920HSP90乳10为整组.11-15为阳组"1