发酵工艺控制课件

第八章发酵过程控制

本章内容一、概述二、代谢调控在发酵过程控制中的应用三、温度对发酵的影响及其控制四、pH对发酵的影响及其控制五、溶解氧对发酵的影响及其控制六、CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制七、基质浓度对发酵的影响及补料控制八、高密度发酵及过程控制九、泡沫对发酵的影响及其控制1.过程控制的重要性

菌株特性(营养要求、生长速率、呼吸强度、产物合成速率)

传递性能

物理：n、T、Ws

化学：pH、DO、浓度

过程控制的意义：即最佳工艺参数的确定以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的控制。决定发酵单位(水平)的因素外部环境因素工艺条件生物因素：设备性能：3.

参数检测代谢参数按性质可分为三类：物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等;化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等;生物参数：菌丝形态、浓度、比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等;3.参数检测参数按获取方式可分为两类：

如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等如摄氧率(γ)、呼吸强度(QO2)、比生长速率（μ)、体积溶氧系数(KLa)、呼吸商(RQ)等。直接参数：

间接参数：将直接参数通过公式计算获得的参数，3.

参数检测参数的测量形式离线测量：基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸、氨基酸等）在线测量：如T、pH、DO、溶解CO2、尾气CO2、黏度、搅拌转速等优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。困难：传感器要求较高。

对传感器的要求能经受高压蒸汽灭菌；传感器及其二次仪表具有长期稳定性；最好能在过程中随时校正，灵敏度好；探头材料不易老化，使用寿命长；安装使用和维修方便；解决探头敏感部位被物料粘住、堵塞问题；价格合理，便于推广。3.参数检测反馈调节包括①反馈抑制：某一生物合成途径的最终代谢物抑制该途径的第一或第二个酶的活性。②反馈阻遏：抑制酶的形成，由途径终点产物或其衍生物施行的。（1）避开固有的反馈调节（1）避开固有的反馈调节方法限制菌在胞内积累终点产物的能力以解除负反馈调节作用从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统，筛选有抗反馈作用的基因突变型（对反馈作用不敏感）。具体应用积累中间产物积累终点产物耐反馈作用的突变株的筛选：抗结构类似物突变株

细胞通透性的变更细胞膜通透性的增加是谷氨酸过量生产的原因之一。能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征：①

α-酮戊二酸脱氢酶缺失：表明这类细菌的TCA上的酶受阻，保证了碳引向谷氨酸的合成歧路。②

对生物素的营养需求：表明这类细菌的生物素的生物合成受阻，导致细胞膜通透性的改变，使细胞可以分泌出谷氨酸。

2.

次级代谢物的生产调节(1)次级代谢的特点及与初级代谢的关系(2)调节方法（1）次级代谢的特点及与初级代谢的关系次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。

操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成改变培养基成分来避免分解阻遏作用改变培养基成分来避免反馈抑制和阻遏作用

e.g.链霉素发酵中限制磷酸盐的加量，避免其对参与生物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵产品的间接抑制作用

分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢碳源或者采用缓慢流加快碳源的工艺

在含有葡萄糖和乳糖的培养基中的青霉素发酵代谢曲线第三节温度变化及其控制

一、温度对生长的影响二、温度的影响与控制三、发酵过程引起温度变化的因素一、温度对生长的影响不同微生物生长对温度的要求不同，根据对温度的要求可分为四类：嗜冷菌适应于0～260C生长，嗜温菌适应于15～430C生长，嗜热菌适应于37～650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长。微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。二、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响1、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到K与温度有关E越大，温度变化对K的影响越大。（一）温度对发酵的影响在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。不同生长阶段的微生物对温度的反应不同处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。（一）温度对发酵的影响发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。酶本身很易因过热而失去活性，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响最终产量。

四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于30℃时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35℃时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。（二）温度影响发酵方向改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。影响生物合成方向。e.g.谷氨酸发酵中扩展短杆菌：30℃培养后37℃发酵，积累过量乳酸。温度对菌的调节机制关系密切。（二）温度影响发酵方向（二）温度影响发酵方向影响酶系组成及酶的特性。米曲霉制曲：温度控制在低限，有利于蛋白酶合成凝结芽孢杆菌的α-淀粉酶热稳定性：55℃培养→90℃保持60min，剩留活性为88%~99%；35℃培养→经相同条件处理，剩余活性仅有6%~10%。定义：最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的生成，它是一种相对概念，是在一定条件下测得的结果。二阶段发酵

e.g.青霉素发酵：菌体生长期,30℃青霉素合成分泌期,20℃（三）最适温度的选择最适温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握通气条件较差情况下，最适发酵温度可能比正常良好通气条件下低一些。培养基成分和浓度的影响（二）最适温度的选择变温培养：在抗生素发酵过程中采用变温培养比用恒温培养所获得的产物有较大幅度的提高。

e.g.四环素发酵：0~30h稍高温度→30~150h稍低温度→150h后升温发酵青霉素发酵：30℃,5h→25℃,35h→20℃,85h

→25℃,40h；产量提高14.7％5.最适温度的选择与控制（三）最适温度的选择1、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～320C，青霉菌生长温度为300C。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。根据生长阶段选择发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段28℃，合成期26℃后期再升温；黑曲霉生长37℃，产糖化酶32～34℃。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。2、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可高些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。3、根据菌生长情况三、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热Q发酵所谓发酵热是发酵过程中释放出来的净热量。净热量:在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。各种产生的热量和散失的热量的代数和。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。1、生物热Q生物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，散发出来的热就叫生物热。1、生物热Q生物影响因素：菌株：有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多培养基成分发酵时期

生物热与其它参数的关系

①呼吸强度QO2②糖利用速率当产生的生物热达到高峰时，菌的呼吸强度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗来衡量生物热。

培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关。在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多；培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌。此外培养基营养越丰富，生物热也越大。2、搅拌热Q搅拌在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关。3、蒸发热Q蒸发

通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。4、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射（二）发酵热的测定一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。

Q发酵＝GCm(T出－T进)

Cm——水的比热G——冷却水流量

另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。小结微生物最适生长温度微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致微生物对温度的要求与酶分子结构的区别有关，如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区域氨基酸的取代，离子束缚作用(ionbinding)减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等温度对发酵的影响：温度影响反应速率温度影响发酵方向最适温度的选择根据菌种生长阶段选择根据培养条件选择菌种的生长情况发酵过程引起温度变化的因素发酵热是引起发酵过程温度变化的原因Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有关搅拌热与搅拌功率有关发酵热测定:冷却容量燃烧热7.16根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？7.17微生物对温度要求不同的原理是什么？7.18发酵过程的温度会不会变化？为什么？7.19发酵热的定义7.20生物热的大小与哪些因素有关？7.21温度对发酵有哪些影响？7.22发酵过程温度的选择有什么依据？思考题第三节发酵过程的pH控制一、发酵过程pH变化的原因二、pH对发酵的影响；三、pH的控制第三节发酵过程的pH控制

发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。必须掌握发酵过程中pH的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。尽管多数微生物能在3~4个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。一、发酵过程pH变化的原因

1、基质代谢

（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降。2、产物形成

某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。

引起发酵液中pH下降的因素（1）C/N过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降；（2）消泡剂加得过多：脂肪酸增加；（3）生理酸性盐的利用；（4）酸性产物形成：如有机酸发酵。引起发酵液中pH上升的因素（1）C/N过低（N源过多），氨基氮（NH4＋）释放；（2）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多；（3）生理碱性盐的利用；（4）碱性产物形成。二、pH对发酵的影响每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围细菌:pH6.3～7.5；霉菌和酵母菌：pH3～6；

放线菌：pH7～8控制一定的pH值，不仅保证微生物生长，而且防止杂菌感染e.g.石油代腊酵母：pH3.5～5.0：生长良好且不易染菌pH>5.0：酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌pH<3.0：酵母生长受抑制，细胞极不整齐，且出现自溶二、pH对发酵的影响

林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。1、实例pH对林可霉素发酵的影响对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。pH7.0t不调pH调pH效价pH发酵过程的pH控制例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响pH在4～7范围内产酶最高2、pH对发酵的影响（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。（4）pH影响代谢方向3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响

生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4

四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0XpH四环素4.最适pH的选择

选择pH准则：获得最大比生产速率和合适的菌体量，以获得最高产量。pH对产海藻酸裂解酶的影响配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对海藻糖水解酶产生的影响pH——菌浓

pH——酶活pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响三、pH的控制

1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.82、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3,或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等3、通过补料调节pH

在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-低，pH高时补(NH4)2SO4不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。“1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联合控制pH值。异亮氨酸发酵4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH

例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）菌株最适生长pH控制在6.8～7.0５、发酵的不同阶段采取不同的pH值不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7.5时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于6.5时菌体同样受抑制，易于老化。而在7.2左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6.9左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。pH6.9时，菌体生长旺盛，pH7.15时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为7.15，到80h后pH值为7.25。产率22.27g·/L，产酸率提高12.23％。例：克拉维酸发酵中pH变换控制问题的提出：在pH低时菌体生长受抑制，在高pH时克拉维酸要分解

用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5。在达到最高细胞浓度后，pH开始从6.5升至8.3。CA产量达最高水平时，pH不再升高。在发酵终止时，pH再次升至8.5。随着pH升高，CA迅速分解。研究不同pH对发酵的影响分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基测定菌的生长和产物合成pH6.0时，生长受抑制，产物降解少pH8.0时生长良好产量低，产物降解pH7.0时的状况控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓度接近相同(约16％PMV)，但控制pH6.0时细胞生长受抑制。在2.5升生物反应器内，不控制pH时2.47μg／(m1·h)控制pH7.0时的产率3.37μg／(m1·h)最高控制pH8.0时，产率2.02μg／(m1‘h)在控制pH6.0时，CA产生被抑制,但降解少因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0，但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各不相同，因此在分批发酵中应用了pH变换策略，使发酵pH由中性pH7.0变换为酸性pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生CA期间控制pH7.0，4d后，当CA产量达最高值时，变换pH为6.0，以减少CA分解。最高CA浓度可保持24h。由于改变pH，使CA分解速率明显降低。pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。总结小结发酵过程pH会发生变化变化原因基质代谢产物形成菌体自溶对发酵的影响pHpH影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离pH影响代谢方向pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响pH的控制方式基础培养基调节pH在基础料中加入维持pH的物质通过补料调节pH

当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH

发酵的不同阶段采取不同的pH值7.12发酵过程中pH会不会发生变化为什么？7.13pH对发酵的影响表现在哪些方面？7.14为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验？7.15发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？思考题本次课重点与难点重点：溶解氧对发酵的影响及其控制CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制基质浓度对发酵过程的影响及补料控制难点：影响发酵过程溶解氧的因素；第四节、溶解氧对发酵的影响及其控制一.

引起溶解氧变化的因素二.溶解氧对发酵的影响三.

溶解氧在发酵过程控制中的重要作用四.发酵液中溶解氧的控制一.

引起溶解氧变化的因素（1）影响溶解氧（DO）的因素（2）发酵过程中溶氧变化规律（1）影响溶解氧（DO）的因素

供氧

耗氧两大类以关系式表示：影响供氧的因素：影响耗氧的因素：

C*-CL温度、溶质、溶剂、氧分压KLa设备参数、操作参数、发酵液特性菌种特性、培养基成分、菌浓、菌龄、培养条件（T、pH）、代谢类型γ（2）发酵过程中溶氧变化规律批式发酵无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象”

溶氧、X、QO2、随时间变化的关系

CLxQO2平衡点分析：①当CL↑，即，OTR>γ∵，∴OTR逐渐↓至OTR=γ，即，高位平衡

当处于高位平衡时，表明供氧性能好。高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。平衡点分析：②当CL↓（如对数生长期γ很大），，OTR<γ∵称低位平衡。低位平衡通常发生在正常情况下的对数期。值得注意的几点自然“波谷现象”，一般可以自适应调节（）当，则需要控制，增加OTR，防止需氧受阻。补料与“波谷现象”对应：即补料时间、剂量选择与溶氧变化有关。

a.

不能在波谷时补料，加重缺氧

b.

一次补料不能过量，防止，菌体停止呼吸、死亡

c.每次补料都会引起一次大的溶氧下降。二.溶解氧对发酵的影响（1）溶解氧对生长的影响（2）溶解氧对产物合成的影响（3）CCr与Cm比较：通常Cm与CCr不一致（1）溶解氧对生长的影响临界氧浓度（CCr）：

当

时,

当

时,∴对生长应满足,但并不是越高越好呼吸抑制呼吸不受抑制指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。（2）溶解氧对产物合成的影响

最适氧浓度（Cm）：溶氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利。e.g.卷须霉素：12~70h之间，维持CL在10%比在0或45%的产量要高。（3）CCr与Cm比较：通常Cm与CCr不一致对于某些菌株Ccr>Cm,卷须霉素:

而有些菌株Ccr<Cm,头孢菌素C：

Cm8%Ccr13~23%Ccr

5%Cm

10~20%QO2(QO2)mCcrCLPCmCL生长阶段要求CL>CCr，生产阶段满足CL≥Cm

三.

溶解氧在发酵过程控制中的重要作用（1）发酵异常指标（2）补料控制指标（3）代谢方向控制指标（4）设备性能、工艺合理性指标（1）发酵异常指标发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。对于好气性杂菌，溶解氧会反常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。对于厌气性杂菌，溶解氧升高。污染噬菌体或其它不明原因引起发酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。

谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线——正常发酵溶解氧曲线-----异常发酵溶解氧曲线—·—异常发酵光密度曲线（2）补料控制指标

中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。

（3）代谢方向控制指标

测量溶解氧可以确定CCr、Cm值通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机e.g.天门冬酰胺酶发酵：45%饱和度

在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一。（4）设备性能、工艺合理性指标评价设备性能、工艺合理性的最终指标：发酵单位

设备反映供氧性能：搅拌桨形式

叶片形式

搅拌器直径d

搅拌档数m和搅拌器间距s

档板宽度w和档板数z

通气：空气分布器的类型和位置n，P/V

设备操作参数

罐压

WS或VVM搅拌设备几何参数改进工艺：控制补料速度、T

的调节、中间补水、添加表面活性剂等等

对现有发酵工厂进行技术改造

浅层次

修改设备和工艺

规模和控制水平上档次

引入新型发酵类型

深层次

工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价：

P/V的改变对溶解氧和产量的影响

e.g.利福霉素发酵：50～80h波谷阶段，P/V↑，KLa↑，供氧↑；3W/L比1W/L批号的发酵单位增加约900u/ml

搅拌转数n对溶解氧和产量的影响e.g.赤霉素发酵：15～50h期间，n从155提高至180r/min，赤霉素单位↑四.发酵液中溶解氧的控制（1）溶解氧控制的一般原则（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一（3）溶解氧控制的工艺方法：从供氧、需氧两方面考虑（4）溶解氧自动控制系统（1）溶解氧控制的一般原则

生长阶段：即可产物合成阶段：即可过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一

控制原理发酵过程中，糖量↑→x↑,QO2↑

→

γ

↑

→

CL↓

糖量

↓→QO2↓→γ↓→

CL↑

补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。

，加大补糖速率

，减小补糖速率实现用溶解氧水平控制补料速率

补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率。

控制原则（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一

控制方法

溶氧和补糖控制系统

溶氧和pH控制的系统

（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一

溶氧在加糖控制上的应用溶氧与pH协同控制系统（3）氧控制工艺方法：从供氧、需氧考虑

供氧方面：提高氧分压（氧分含量），即，提高供氧能力改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力

通气速率Ws↑：Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫提高罐压：

，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。

改变发酵液理化性质（σ，，Ii）

加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分→改变KL改变温度：，提高推动力（C*－CL）（3）溶解氧控制的工艺方法（续）

供氧方面：（3）溶解氧控制的工艺方法（续）耗氧方面限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度→限制μ、x→

限制γ→控制溶解氧（4）溶解氧自动控制系统改变通气速率的溶氧控制系统改变搅拌转速的溶氧控制系统改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统

溶解氧对被孢霉合成花生四烯酸(AA)的影响

溶氧量对AA产量的影响注：摇床转速150r/min,25℃

KLa越大，培养基中溶解氧越多,

AA合成速度越快第六节、CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制一、定义二、发酵过程中CO2释放率的变化三、CO2对发酵的影响1.定义

呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况。菌体耗氧速率OUR，molO2/L·h

菌体CO2释放率CER，molCO2/L·h（1）影响尾气中CO2浓度的因素

通入空气量：呼吸强度：CO2溶解度：菌体量：（2）CER变化规律

CO2积累量渐增，与X曲线对应，基本类似S型曲线变化；当工艺和设备参数一定的情况下，CER与X有比例关系（CER∝菌体生长速率）；CO2浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系。∫[CER]dt，菌体干重的时间曲线1-[CER]dt；2-菌量（1）研究参数CO2的意义

作为代谢产物或中间前体，尾气中CO2积累与生物量成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与控制；尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。（2）CO2对细胞的作用机制“麻醉”作用

CO2及HCO3-都会影响细胞膜的结构，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。

（3）CO2对菌体生长及产物形成的影响

CO2↑,基质分解速率↓，ATP↓，中间产物↓或形态变异导致产量↓高浓度CO2抑制作用的独立性:只要CO2在培养液中浓度过量，即使供氧充足（CL>CCr），CO2的抑制作用不能解除，这种负作用在放大过程更明显。正确评价通气的作用：供氧：排废气：水分及挥发性组分的散失

（4）CO2释放与发酵过程参数pH及操作参数补糖速率的关系在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加，同时pH下降。糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感，所以测定排气CO2释放率（CER）来控制补糖速率。

补糖与溶氧及pH协同控制补糖速率与CER控制

补糖对排气CO2和pH的影响（5）尾气CO2与O2的相关性

相关程度表示：尾气CO2与O2相关性：反向同步关系呼吸商（RQ）与发酵的关系不同菌株、同一菌株不同代谢途径、同一菌株利用不同基质、同一菌株在不同发酵阶段，RQ值不相同。RQ值可以表征发酵状况。

青霉素发酵不同阶段：

菌体生长阶段：RQ＝0.909

维持阶段：RQ=1

生产阶段：RQ=4如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，当产物的氧化性比基质大时，RQ值就要减少，其偏离程度决定于单位菌体利用基质形成产物的量。

产物形成对RQ影响最大（七）基质浓度对发酵过程的影响及补料控制1.基质浓度对发酵的影响2.补料控制（1）基质浓度对微生物生长的影响s<<KS情况下，比生长速率与基质浓度呈直线关系：一般情况下符合Monod方程式基质浓度高时

(2)基质浓度对产物合成的影响低浓度限制低水平诱导高浓度抑制及分解阻遏作用e.g.葡萄糖氧化酶发酵：葡萄糖用量从8%降至6%，补入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高26%或6.7%。

谷氨酸发酵（乙醇为碳源）：当乙醇浓度为2.5g/L和35g/L时，可延长谷氨酸生产时间，但在更高浓度下，菌体生长受到抑制，谷氨酸产量降低。（1）补料的目的解除基质过浓的抑制解除产物的反馈抑制解除分解代谢物阻遏作用避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而造成波谷现象。在生产上，补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段。（2）补料的内容

补充微生物能源和碳源补充菌体所需要的氮源补充微量元素或无机盐添加前体、诱导剂等（3）补料的原则中间补料的数量为基础料的1～3倍。补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质以经验数据或预测数据控制流加；用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加；以溶氧、pH、RQ、排气中CO2分压及代谢物质浓度等参数间接控制流加；以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加。（4）补料控制的策略（5）反馈控制参数的确定为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。

e.g.谷氨酸发酵

在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间存在着线性关系。K=1.51K=1.75K=2.16谷氨酸发酵中K值对糖浓度的控制的影响（6）补料速率的确定优化补料速率是补料控制中十分重要的一环，补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所设定的培养液中最低维持浓度而定。补糖速率最佳点与设备的供氧能力有关。e.g.青霉素发酵：KLa大的设备补料速率相应大些；供氧低的设备，补料速率相应减少，产量比供氧能力好的设备降低23％。（7）实例：四环素发酵中的补糖控制补糖时间对四环素发酵单位的影响Ⅰ－补糖时间适当（45h后加）Ⅱ－补糖时间过晚（62h开始加）Ⅲ－补糖时间过早（20h后加）

维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用补糖对四环素发酵的影响

在最适补加葡萄糖的条件下，能正确控制菌丝量的增加、糖的消耗与发酵单位增长三者之间的关系，就可获得比采用丰富培养基时更长的生物合成期。

维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用（八）高密度发酵及过程控制1.

高密度发酵2.高密度发酵策略3.高密度发酵技术4.高密度发酵存在的问题1.高密度发酵代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广泛的重视。高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态。

高细胞密度发酵成功的实例2.高密度发酵策略使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得率。优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率。可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发酵来实现高密度发酵。3.高密度发酵技术用于高密度发酵的生物反应器类型：搅拌罐，透析膜反应器，气升式反应器，气旋式反应器在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来进行高细胞密度发酵。重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，限制性基质（葡萄糖）的流加模式有3种：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料。4.高密度发酵存在的问题水溶液中的固体与气体物质的溶解度，基质对生长的限制或抑制作用，基质与产物的不稳定性和挥发性，产物或副产物的积累达到抑制生长的水平，高浓度的CO2与热的释放速率，高的氧需求以及培养基的粘度不断增加等

。泡沫的产生通气和搅拌代谢气体的逸出存在稳定泡沫的表面活性物质1.泡沫的产生及其影响1.泡沫的产生及其影响泡沫的类型一类存在于发酵液的液面上。气相所占比例特别大，并且泡沫与下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫。一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的液面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。3、泡沫产生的原因

发酵过程中因通气搅拌、发酵产生的CO2以及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质的存在，使发酵液含有一定数量的泡沫。发酵液的理化性质对泡沫性质决定性的作用气体在纯水中鼓泡，由于能学上的不稳定和围绕气泡的液膜强度很低，生成的气泡只能维持瞬间，其稳定性等于零。发酵液中的玉米浆、皂苷、糖蜜所含的蛋白质，细胞本身具有稳定泡沫的作用。发酵液的温度、pH、溶质浓度以及泡沫的表面积对泡沫的稳定性也有一定的作用。亲水基疏水基表面活性剂是由疏水基与亲水基构成的化合物，在水中，表面活性剂的分子不停地转动在以下两种情况下泡沫才能比较稳定，停留时间比较长：起泡剂是表面活性物质，具有一些亲水基团和疏水基团，分子带极性的一端向着水溶液，非极性一端向着空气，在表面作定向排列，增加泡沫的机械强度。第一种情况表面活性剂的亲水基留在水相，疏水基伸到气相中，形成定向吸附层第二种情况表面活性剂的疏水基在水相中互相靠在一起，减少疏水基与水的接触，形成“胶束”。胶束定向吸附层溶液中当表面活性剂的