谈慢性铝暴露对大鼠海马钙离子稳态及CaMKⅡ和CREB 活性的影响论文

谈慢性铝暴露对大鼠海马钙离子稳态及CaMKⅡ和CREB活性的影响论文谈慢性铝暴露对大鼠海马钙离子稳态及CaMKⅡ和CREB活性的影响论文铝(Al)是一种慢性神经毒性物质，随着铝的生物利用度增加，其与很多神经变性疾病密切相关，包括阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森痴呆和海湾战争综合征。动物实验证实，Al盐可引起很多动物脑内构成神经纤维缠结(NFT)病理变化，如兔、猫、小鼠、大鼠和猴。最新的研究结果也证实，Al暴露可导致脑内产生AD样病理变化以及认知障碍，并且饮水中Al含量与AD患者死亡率呈正相关。慢性Al暴露能够加强AD患者脑内NFT和Aβ的构成，进而增加淀粉样斑块的体积和数量。在神经元中，钙离子(Ca2+)持续性升高可造成神经毒性，与急慢性神经退行性病变中的神经损伤密切相关。神经元内的Al能够影响静息Ca2+水平，减慢Ca2+流出细胞质。同时，Al能够抑制调节Ca2+的相关蛋白表达。因而，了解铝暴露对Ca2+稳态的影响对于明确铝神经毒性的机制，具有特别重要的意义。Ca2+/钙调蛋白(CaM)依靠的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是神经细胞兴奋性转录耦联的关键媒介，也是突触可塑性改变的关键蛋白。此外，cAMP反响元件结合蛋白(CREB)是CaMKⅡ的下游分子之一，在突触可塑性中具有重要作用，激活CREB可促进多种与突触可塑性相关的转录因子的转录，进而诱导产生一些与学习记忆特别相关的蛋白分子。研究表明，Al在脑内特定的敏感区域内选择性地沉积，如海马区等。但是，慢性Al暴露对大鼠海马区神经元内的Ca2+稳态以及其下游CaMKⅡ、CREB信号分子活性的影响尚未见报道。1材料与方法1.1主要材料选择60只断乳后Wistar大鼠(体重约30g)，由中国医科大学实验动物中心提供。CREB抗体、磷酸化(p)-CREB抗体(CellSignal公司);CaMKⅡ抗体、p-CaMKⅡ抗体、神经颗粒素(Ng)抗体(美国SANTACruz公司)、β肌动蛋白(β-actin)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(北京中杉生物公司);ECL发光试剂(美国Sigma公司)、Chemilmager5500V2103(美国)。其他试剂均为分析纯。1.2动物模型建立将60只(AlCl3)大鼠随机分3组，每组20只。对照组用蒸馏水喂养，Al暴露组分别用含有0.2%和0.4%氯化铝的蒸馏水喂养。动物室温度保持在18℃～23℃、相对湿度为45%～55%，光照时间12h∶12h。Al暴露大鼠保持健康，体重为对照大鼠的(90±6)%。3个月后，进行大鼠学习记忆的行为学及其他生化指标测定。1.3Morris水迷宫测定大鼠学习记忆行为参考文献的方法，Morris水迷宫测试在内径180cm、高60cm的圆形水池中进行。水深48cm，水温为(22±0.5)℃，水池内放入奶粉使之成为乳白色。将水池分为西南、西北、东南和东北(SW、NW、SE和NE)四个象限，NW象限正中距池壁20cm处放置逃避平台(直径约8cm)，平台位于水下2cm。水池正上方安装带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹，实验期内迷宫外参照物保持不变。Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验两个部分，根据相关文献，简单地讲，实验大鼠天天游泳4次，分别从不同象限将动物头朝池壁入水，并在水池上标定一样一点作为每次实验大鼠的入水点，寻找平台时间上限设置为120s。假如在规定时间内未找到平台，由实验者将其引导至平台并停留30s以加强记忆，缓解紧张情绪。逃避潜伏期记录为120s，每只大鼠的游泳时间间隔为15min。观察和记录120s内大鼠穿越平台的次数、在原平台象限搜索时间占总时间的百分比和在原平台象限搜索距离占总距离的百分比，并记录大鼠在120s内搜索平台的道路图。空间探索实验只进行1次。1.4脑组织和血液中Al含量测定根据文献，准确分离并称取各组大鼠海马组织(约0.1～0.5g)或准确汲取0.2～0.5ml的全血于石英烧杯中，放入聚四氟乙烯(PTFE)中，参加5～8ml混酸(硝酸∶高氯酸体积比为4∶1)，同时做空白对照。低温加热至试样全部溶解，继续加热蒸发至近干后加0.2%硝酸溶解残留物，并以0.2%硝酸定容至50ml，采用石墨炉原子吸收分光光度法测定脑铝或血铝含量。1.5大鼠海马神经细胞内Ca2+含量测定〔20〕冰上分离大鼠海马组织后，放入D-Hank液中。37℃下用0.125%胰酶消化20min，反复吹打后离心，制备密度为106～107个/ml的单细胞悬液。台盼蓝染色，确定分离出的单细胞存活率在95%以上。将终浓度为4μmol/L的Fura-2/AM参加上述分离出来的细胞悬液中，37℃下孵育35min后，用含0.2%BSA的Hank液清洗残留的Fura-2/AM。然后，将细胞重悬于无Mg2+的Hank液中(mmol/L):HEPES10，KCl5.0，NaCl145，CaCl21.3，L-glucose10，Na2HPO4。采用日立F-3000型荧光双波长分光光度计测定细胞Ca2+浓度。激发光波长设定为340～380nm，发射光波长为510nm。根据下面公式计算Ca2+浓度〔Ca2+〕i=Kd〔(R-Rmin)/(Rmax-R)〕(Fmin/Fmax)。Kd值为224nmol/L，R为荧光值，〔Ca2+〕i为nmol/L，而Fmin为参加EGTA后测得的荧光值，Fmax为参加TritonX-100后测得的'荧光值。1.6逆转录实时PCR法检测mRNA表达冰上分离各组大鼠海马组织，根据TRIzol讲明书(Invitrogen，USA)抽提各组海马组织的总RNA。应用紫外分光光度仪测定RNA样品260/280nm波长处吸光度比值为1.9～2.0。根据试剂盒讲明书要求，采用oligo(dT)和superscriptⅡ进行逆转录后，用双标记荧光探针混合物(SYBRGreenPCRMastermix)在ABIprism7500自动序列分析系统(Biosystems)中进行实时定量PCR分析，每组重复3次。CaMKⅡ基因引物特异序列分别为5-AGCCATCCTCACCACTAT-3(上游)和5-CTTCACGCCATCATTCTTC-3(下游);CREB基因引物特异序列分别为:5-CCAGCCATCAGTTATTCAGT-3(上游)和5-TTACACTATCCACAGACTCCT(下游);β-actin作为内参照，其引物特异序列为5-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3(上游)和5-GGATCTTCATGAGGTAGTCAG-3。两种基因扩增结果用β-actin进行标化。1.7免疫印迹检测蛋白表达采用颈椎脱臼法处死大鼠，冰上分离大鼠海马，剔除血管。在每个装有海马的离心管中，根据1∶9比例参加裂解液(10mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，100mmol/LNaCl，50mmol/LNaF，1%TritonX-100，1mmol/LNa3VO4，1mmol/LPMSF)，1μg/ml亮肽素，1μg/ml抑蛋白酶(SantaCruz，USA)，50mmol/Lβ-glycerolphosphate，1mmol/L二硫苏糖醇和0.09%Brij-35。4℃下超声粉碎后27000g离心1.5h，取上清，即总蛋白提取液。BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度，取50μg总蛋白，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(110V，2h)。待电泳完成后，把蛋白转印至硝酸纤维素(NC)上。分别用抗tCREB、p-CREB(Ser133)(1∶100)、Ng(1∶500)、p-CaMKⅡ(1∶500)和β-actin(1∶1000)抗体孵育，最后参加HRP标记的相应二抗，ECL发光并成像分析。1.8免疫组化检测蛋白表达各组大鼠经4%多聚甲醛灌流固定后取海马组织，30%蔗糖(用4%多聚甲醛配置)后固定48h，冷冻切片(40μm/片)。分别经0.3%过氧化氢甲醇溶液、0.3%Triton-100处理后，0.01mol/LPBS清洗5min×3次。参加一抗CaMKⅡ(1∶200)4℃孵育过夜、二抗(1∶1000)室温下孵育2h、DAB法显色。1.9统计学分析应用SPSS11.0软件，组间资料统计用单因素方差分析(ANOVA)。采用单因素重复测量方差分析评估行为学数据。2结果2.1慢性Al暴露可诱导大鼠学习记忆损伤Morris水迷宫测试结果表明，与对照组相比拟，铝暴露各组大鼠的穿越平台次数、在原平台象限搜索时间占总时间的百分比和在原平台象限搜索距离占总距离的百分比显著降低(P0.05);在慢性Al暴露各组之间，0.4%AlCl3组大鼠穿越平台次数和搜索距离明显低于0.2%AlCl3组(P0.05)，呈现剂量依靠性;各组搜索时间无统计学差异。2.2慢性Al暴露可增加大鼠血Al和海马组织内Al的含量与对照组相比拟，Al暴露各组大鼠的血液和海马组织中Al含量明显增加(P0.05);在Al暴露各组大鼠之间，0.4%AlCl3__组大鼠的血Al和海马组织Al含量明显高于0.2%组(P0.05)。2.3慢性Al暴露可增加大鼠海马神经细胞内的自由钙离子(〔Ca2+〕i)浓度与对照组相比，Al暴露各组大鼠海马神经细胞内〔Ca2+〕i明显增高，从(155.75±15.33)nmol/L(对照组)分别增至(515.92±53.59)nmol/L(0.2%AlCl3组)和(646.87±62.32)nmol/L(0.4%AlCl3组);与0.2%AlCl3组相比，0.4%AlCl3组大鼠海马神经细胞内〔Ca2+〕i显著升高(P0.05)。2.4慢性Al暴露对CaMKⅡ和CREBmRNA表达的影响各组CaMKⅡ及CREBmRNA表达无显著变化(P0.05)。对照组设为1，0.2%AlCl3组与0.4%AlCl3组CaMKⅡmRNA表达量分别为0.98±0.21、1.11±0.18，CREBmRNA表达量分别为0.99±0.19、1.03±0.15。2.5慢性Al暴露对CaMKⅡ和CREB总蛋白表达的影响免疫组化结果显示，各组CaMKⅡ染色密度元显著差异(P0.05)。同时，Western印迹结果也显示(图1)，各组CREB总蛋白表达水平无显著变化(P0.05)，CREB总蛋白表达分别为0.55±0.065(对照组)、0.54±0.062(0.2%AlCl3组)和0.57±0.064(0.4%AlCl3组)(P0.05)。2.6慢性Al暴露影响学习记忆关键蛋白分子CaMKⅡ和CREB的活性与对照组相比，Al暴露组大鼠海马组织中p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表达水平均明显降低(P0.05);同时，随着Al暴露浓度的增加，p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表达逐步降低，呈剂量依靠性(P0.05)。3讨论Al暴露因素是AD发病机制中研究最多的环境风险因素。Al在神经系统中的蓄积可产生毒性作用，导致神经元损伤，进而引起智力和认知能力的缺欠。同时，AD患者脑Al含量较高，神经原纤维缠结(NTFs)中含有高浓度的Al。因而，研究Al暴露与AD的关系特别重要。Morris水迷宫行为学评估结果证实，慢性Al暴露确实能够造成大鼠的学习记忆损伤，这些结果与以往国内外一些研究的结果类似。Ca2+对真核细胞的代谢及各种生理功能具有特别重要的作用，并且细胞外Ca2+浓度远远高于细胞内Ca2+浓度。此外，在神经系统中，Ca2+作为最基本的第二信使，能够调节神经递质的释放、调控突触可塑性，甚至是基因表达。有研究表明，Al3+离子半径与Ca2+类似，能够与Ca2+结合位点作用，进而在一定程度上影响细胞内的钙稳态。在体外培养的条件下，Al暴露后可显著提高星形胶质细胞内Ca2+浓度。我们的实验结果证实，慢性Al暴露可显著提高大鼠海马神经细胞内的Ca2+浓度，并呈剂量依靠性。此结果与慢性Al暴露可显著增加神经突触内钙浓度的研究结果类似。CaMKⅡ是空间学习和记忆的分子基础，Ca2+内流可磷酸化激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ从细胞质移动到突触并结合NMDA型谷氨酸受体，而CaMKⅡ-NMDA受体复合物是诱导长时程加强的关键分子。研究表明，在LTP后期，CaMKⅡ具有放大并强化突触可塑性的构造性功能。我们的结果证实，慢性Al暴露并未影响大鼠海马区CaMKⅡ总蛋白的表达，但是却降低了p-CaMKⅡ的表达，讲明Al暴露可抑制CaMKⅡ的活性。Ng是一种突触后蛋白，能够与CaM单体结合，对于CaMKⅡ的活性具有重要的影响。研究表明，Ng增高能够增加CaMKⅡ激活，进而加强突触可塑性;而在Ng敲除的小鼠中，CaMKⅡ的活性也明显降低。我们的结果表明，Al暴露能够降低大鼠海马神经细胞中Ng的蛋白表达。因而，总体来讲，慢性Al暴露干扰了大鼠海马神经细胞的钙稳态，降低了p-CaMKⅡ和Ng的蛋白表达，这可能是Al暴露诱导学习记忆损伤、诱导AD发病的机制之一。CREB是一种分子量为43kD的核转录因子蛋白，对于神经突触可塑性长时间的改变具有特别重要的作用。CREB上的丝氨酸(Ser)133是很多蛋白激酶的作用靶点，例如CaMKⅡ和Ⅳ、蛋白激酶A和蛋白激酶C