微生物的生长繁殖及其控制

第一节微生物生长的测定评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；微生物生长第一页，共五十页。微生物生长测量方法个体计数法重量法生理指标法第二页，共五十页。1.个体计数法a.直接法利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；第三页，共五十页。b.简接法原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。第四页，共五十页。2.重量法通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；第五页，共五十页。3.生理指标测定法样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。第六页，共五十页。生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加

生长指生物个体数目的增加

繁殖

在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。

群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程第七页，共五十页。个体生长个体繁殖群体生长群体生长个体生长+个体繁殖由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况第八页，共五十页。第二节微生物的生长规律一、细菌群体生长规律

在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线第九页，共五十页。生长曲线可分：延滞期对数期衰亡期稳定期第十页，共五十页。1.延滞期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；②利用对数生长期的细胞作为“种子”；③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：第十一页，共五十页。2.对数期

指数期的特点细菌数量呈对数增加生长速度常数R最大细胞进行平衡生长酶系活跃，代谢旺盛影响指数期微生物增代时间的因素菌种营养成分营养物的浓度

发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度

第十二页，共五十页。细菌研究中常用的三个参数（1）繁殖代数（n）指数生长方式：1248……2n

设接种时细胞数为x1,时间为t1,到时间t2后，繁殖n代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为：x2=x1*2n以对数表示：㏒x2=㏒x1+n㏒2㏒x2-㏒x1∴n==3.322(㏒x2-㏒x1)㏒2第十三页，共五十页。（2）生长速度常数（R）

n㏒x2-㏒x1

R==t2–t1log2(

t2–t1)（3）代时(G)1t2–t1G==R3.322(㏒x2-㏒x1)第十四页，共五十页。特点：

1生长速率常数R等于02菌体产量达到了最高值3合成次生代谢产物4细胞内出现储藏物质，芽孢菌内开始产生芽孢产生原因：

营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适通过补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等获得更多的代谢产物3.稳定期第十五页，共五十页。4.衰亡期特点：

1R为负值2细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形3释放次生代谢产物，芽孢等4菌体开始自溶产生原因：

生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡第十六页，共五十页。二、同步培养

1.概念同步培养(synchronousculture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。第十七页，共五十页。同步培养方法机械方法环境条件控制技术离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养第十八页，共五十页。硝酸纤维素滤膜法离心法第十九页，共五十页。三、连续培养

连续培养(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物连续培养类型恒浊连续培养恒化连续培养第二十页，共五十页。(一)恒化连续培养在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。第二十一页，共五十页。第二十二页，共五十页。(二)恒浊连续培养通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业第二十三页，共五十页。第二十四页，共五十页。(三)连续发酵与单批发酵相比优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化第二十五页，共五十页。第三节环境因素对微生物的影响影响因素：氧温度PH值第二十六页，共五十页。(一)温度根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等五种不同的类型。它们都有各自的最低、最适和最高生长温度范围。

微生物类型

生长温度／℃最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580超嗜热或嗜高温微生物6580-90100以上最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度第二十七页，共五十页。(二)PH微生物最低PH最适PH最高PH细菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8

微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的pH范围。第二十八页，共五十页。(三)氧根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧微好氧耐氧型兼性厌氧专性厌氧微生物类型最适生长的O2体积分数好氧微好氧氧的忍耐型兼性厌氧专性厌氧等于或大于20％2％一lO％2％以下有氧或无氧不需要氧、有氧时死亡第二十九页，共五十页。第三十页，共五十页。自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶，可催化起氧化基化合物分解，最终分解成水。氧对于好氧微生物生长虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物，如超氧基化合物与H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基OH.。

第三十一页，共五十页。第四节微生物生长繁殖的控制一、基本概念防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施化疗(chemotherapy)：利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织成病受细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。第三十二页，共五十页。二、控制微生物的化学物质

1．抗微生物剂抗微生物剂(antimicrobialagcnt)是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质根据它们抗微生物的特性可分为：

抑菌剂

杀菌剂

溶菌剂

用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜

第三十三页，共五十页。抗微生物剂通常又将它们分为消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。HgCl2、CuSO4、碘液、氯气、乙烯氧化物、甲醛剂、臭氧有机汞、0.1%-1％硝酸银、碘液、70%乙醇、3％过氧化氢第三十四页，共五十页。各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸第三十五页，共五十页。2．抗代谢物(Antimetabolite)有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。叶酸对抗物（磺胺）、嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）、苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）第三十六页，共五十页。磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病。大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等）某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用。作用机理：磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。第三十七页，共五十页。3．抗生素抗生素(Antibiotic)是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。(1)概念自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅几十种。第三十八页，共五十页。(2)作用机制抑制细菌细胞壁合成破坏细胞质膜作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化抑制蛋白质和核酸合成第三十九页，共五十页。第四十页，共五十页。(3)细菌抗药性的产生抗性菌株特点：细胞质膜透性改变，使抗生素不进入细胞或进入细胞后被细胞主动排出；药物作用靶改变；合成了修饰抗生素的酶；抗性菌株发生遗传变异，导致合成新的多聚体，以取代或部分取原来的多聚体；第四十一页，共五十页。(4)应用抗生素注意(1)第一次使用的药物剂量要足；(2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；(3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用；(4)对现有抗生素进行改造；(5)筛选新的更有效的抗生素；第四十二页，共五十页。三、控制微生物的物理因素

温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波第四十三页，共五十页。1.高温灭菌①高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌的温度越高，微生物死亡越快。通常情况下温度为121.3℃。衡量灭菌效果的指标十倍致死时间(decimalreductiontime)：即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间。热致死时间(thennaldeathtime)：即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的