专题-序列分析和引物设计课件

序列分析及引物设计专题郭志富2012年11月21日测序序列如何确定是否为目的序列？如何去除载体序列？如何转换成有义链？如何找到序列起始和终止位置？一、序列分析部分第一步：BLAST输入测序序列选择物种选择比对类型去除序列中此数字之前的序列，一般前50-80bp要么是载体序列，要么是测序不准确的端部一般序列较短时，开始比出来的有可能是载体序列，此时需在测序序列中去掉比对数字之后的序列，也就是去除和载体序列一致的序列。把目的序列重新输入进行比对。第二步：序列整理与分析---DNAman软件的应用粘贴待分析序列序列的不同显示类型（互补、反向、反向互补等）去除此部分后保存，即得到反转后的有义链此图对于设计体外表达引物或转基因载体构建引物十分重要。原则为：设计引物添加酶切位点必须是目的基因中没有的酶切位点。多序列比对应用：简并引物设计差异位点分析（SNP或氨基酸差异等）进化树的构建保守区DNAMAN1形式DNAMAN2形式GCG形式GDE形式选择某区段引物设计专题分子生物学实验基础之生物科学技术学院郭志富2011年11月8日简并引物设计：基于保守区设计，用于保守区片段（或中间片段）获得定量引物设计：用于半定量和实时荧光定量PCR标记引物设计：基于特异区设计，用于标记特异基因或特异物种材料。表达引物设计：用于原核体外表达、真核表达（转基因）SNP引物设计：用于单核苷酸突变鉴定RACE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段甲基化引物设计：用于检测基因甲基化情况。。。。。。引物设计分类ＰＲＩＭＥＲ５.０的常规应用结合ＤＮＡＭＡＮ激活软件？获取激活码“Ctrl+V”输入序列也可以把上下游引物分别设在序列的某一特定位置界定产物长度界定引物长度在55-65之间调整简并性引物的设计1.基于保守性的简并位置选择（3‘端尽量不设置简并）2.用Primer5.0检测大致的评分（主要看Tm值和发夹结构和引物二聚体情况）复制同源克隆---基于不同物种（范围较广）相应序列保守区的引物设计---通过已知序列信息钓取未知的同源基因“Ctrl+V”输入引物序列上游引物下游引物简并引物的确定（上游）5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3如确定该位置为下游引物3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5表达引物的设计ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC起始信号肽编码区N端编码区终止ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA上游引物的设计添加ATG起始密码子5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3添加酶切位点1.编码区内不含该位点2.5’端添加保护碱基2-3个（网上有规律表）3.不能造成下游的移码去除信号肽编码区部分1.位置必须选择含终止密码子子位置或终止密码子之后不远的一部分序列，2.记得要是有义链的反向互补链，3.同样加酶切位点和保护碱基下游引物的设计定量引物的设计扩增长度：100-300bp范围即可以mRNA为模板进行设计尽量避免引物二聚体、发夹结构等的出现引物设计避免DNA污染可能带来的干扰，最好跨外显子接头区

Tm值在58-62度内参引物设计：选取持家基因，如18SRNA、actin等长度与特异基因有所差异设计范围在编码区内界定产物长度在100-300bp应用Primer5.0软件常规应用功能即可标记引物的设计（特异性）选择非保守区段，特异性的位置设计在3‘末端；（SSR等特征序列的两侧）特异区段RACE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段RACE引物的设计如果基因是多拷贝或为多基因家族，须在所得不同片段特异区设计与接头引物Tm值相差不宜过大产生嵌套引物，位置合理SNP引物的设计何谓SNP？SNP位点设置在3‘最后一个碱基倒数第三个碱基人为引入突变----保证引物特异性5-CTAGGTACTGGATTAGT-3甲基化引物的设计何谓甲基化？----亚硫酸氢盐----C变T准确寻找甲基化位点，至少一个，多多益善设计野生型对照CpG位置尽量靠3‘端一段基因组的序列是：5-GAGGGGCGGCCGCACCGGG-3

甲基化引物：5-GAGGGGCGGTCGTATCGGG-3非甲基化引物：5-GAGGGGTGGTTGTATTGGG-33.MEGA3.1软件的应用第一步:点击file,选择”converttoMEGAformat”点击选择保存过的CLUSTAL