20章自动化仪器分析-XXXX

第二十章免疫检验自动化仪器分析1．了解免免疫检测测自动化化的基本本概念2．了解免免疫检测测自动化化设计的的基本原原理3．了解免免疫检测测自动化化仪器在在临床上上的应用用4．掌握常常用的几几种免疫疫检测自自动化仪仪器的检检测原理理、应用用以及评评价，本章重点点免疫检验验自动化化(automationofimmunoassays))是将免疫疫学反应应检测过过程中的的取样、、加试剂剂、混合合、温育育、固相相载体分分离、信信号检测测、数据据处理、、打印报报告和检检测后的的仪器清清洗等步步骤由计计算机控控制，自自动化进进行。第一节自自动动化免疫疫浊度分分析系统统免疫浊度度分析属属液相沉沉淀试验验，其基基本原理理是：抗原、抗抗体在特特定的电电解质溶溶液中反反应，形形成小分分子免疫疫复合物物（<19S），在增增浊剂（（如PEG、NaF等）的作作用下，，迅速形形成免疫疫复合物物微粒（（>19S），使反反应液出出现浊度度。在抗抗体稍微微过量且且固定的的情况下下，形成成的免疫疫复合物物量随抗抗原量的的增加而而增加，，反应液液的浊度度亦随之之增大，，即待测测抗原量量与反应应溶液的的浊度呈呈正相关关。一、免疫疫透射比比浊法【原理】一定波长长的入射射光线通通过抗原原抗体反反应后的的溶液时时，被其其中的免免疫复合合物微粒粒吸收、、反射和和折射而而减弱(图9-7))，在一定定范围内内，吸光光度与免免疫复合合物量呈呈正相关关，而形形成的免免疫复合合物量与与参与反反应的抗抗原和抗抗体的量量呈函数数关系。。与已知知浓度的的抗原标标准品比比较，可可确定标标本中抗抗原含量量。二、免疫疫胶乳比比浊法原理用抗体致致敏的大大小适中中、均匀匀一致的的胶乳颗颗粒（一般为为0.2μm），在遇到相相应抗原原时，胶胶乳颗粒粒上的抗抗体与抗抗原特异异结合，，引起胶胶乳颗粒粒凝聚，使透射光和和散射光光即出现现显著变变化。如如图所示示：a为单个胶胶乳颗粒粒不阻碍碍光线透透过，b为抗原抗抗体结合合形成的的凝聚胶胶乳大颗颗粒使透透射光减减弱或散散射光增增强。三、免疫疫散射比比浊法【原理】粒子对光光线的散散射作用用是溶液液中的微微粒子受受到光线线照射后后，微粒粒子对光光线产生生反射和和折射而而形成散散射光。。悬浮微微粒对光光散射形形成的散散射光强强度与微微粒的大大小、数数量、入入射光的的波长和和强度、、测量角角度等因因素密切切相关，，其公式式如下：：式中Iθ为与入射射光成θ角处散射射光强度度；λ和I0为入射光光的波长长和强度度；dn/dc为校正因因子，反反映了溶溶液折射射指数和和颗粒浓浓度的变变化；M为颗粒分分子量；；c为浓度；；N为阿佛加加德指数数；γ为颗粒到到检测器器的距离离；θ为散射光光与入射射光的夹夹角（散散射夹角角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc))2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4颗粒直径径<1/10λRayleigh散射1/10λ<颗粒直径径≤λDebye散射颗粒直径径≥λMile散射㈠定时散射射比浊法法（fixedtimenephelometry）定时散射射比浊法法是在保保证抗体体过量的的情况下下，加入入待测抗抗原，此此时反应应立即开开始，在在反应的的第一阶阶段，溶溶液中产产生的散散射光信信号波动动较大，，所获取取的信号号计算出出的结果果会产生生一定的的误差。。定时散散射比浊浊法是避避开抗原原抗体反反应的不不稳定阶阶段，即即散射光光信号在在开始反反应7.5s～2min内的第一一次读数数，专门门在抗原原抗体反反应的最最佳时段段进行读读数，将将检测误误差降到到最低。。㈡速率散射射比浊法法（ratenephelometry）速率散射射比浊法法是抗原原抗体结结合反应应的动力力学测定定法。所所谓速率率是指抗抗原抗体体反应在在单位时时间内形形成免疫疫复合物物的速度度（不是是免疫复复合物累累积的量量），连连续测定定各单位位时间内内复合物物形成的的速率与与其产生生的散射射光信号号联系在在一起，，形成动动态的速速率散射射比浊法法，每项项检测仅仅1min～2min即可完成成。表抗原原抗体复复合物形形成的速速率累计时间（s）形成IC总量速率累计时间（s）形成IC总量速率5

8－10

13

515

25

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60

3525

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415

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20抗原抗体体反应速速率的动动态变化化BNProSpec全自动特特定蛋白白分析仪仪BNP防抗原过过量的设设计：优化反应应条件，，令初始始稀释度度分析范范围更宽宽，保证证抗原抗抗体反应应呈最佳佳比例预反应程程序：IgM，LamU，AlbU，β2MUVLinIntegral计算程序序定时散射射比浊法法测定原原理示意意图IMMAGE全自动特特定蛋白白分析仪仪一、特异异性二、比例例性三、可逆逆性一、抗体体来源：：兔，羊羊，----二、亲合合力三、浓度度四、电解解质，((增浊剂剂)五、pH六、温度度抗原抗体体反应的的特点抗原抗体体反应的的影响因因素抗体抗体的质质量特异性强强，效价价高，亲亲和力强强，R型抗体的含含量抗体过量量抗体的特特异性抗体只针针对相应应的抗原原，非特特异性的的交叉反反应会引引起伪浊浊度。抗体的效效价一个合格格的比浊浊用抗体体其效价价必须在在1：20（抗体稀稀释度））以上，，否则易易形成伪伪浊度。。抗体的亲亲和力亲和力强强则抗体体活性高高，不仅仅可以加加快抗原原抗体反反应速度度，而且且形成的的免疫复复合物较较牢固，，不易发发生解离离。R型抗血清清以家兔为为代表的的小动物物血清，，如豚鼠鼠、大白白鼠、家家兔、家家禽、羊羊等动物物的免疫疫血清。。这类抗血血清亲和和力高，，与抗原原结合后后不易再再解离，，抗体过过剩时易易形成大大而稳定定的复合合物，抗抗原过剩剩时则形形成可溶溶性复合合物。H型抗血清清以马为代代表的大大动物血血清，如如驴、骡骡、马等等动物的的免疫血血清。该血清亲亲和力弱弱，抗原原抗体结结合后极极易再解解离，抗抗原过剩剩和抗体体过剩皆皆易形成成可溶性性复合物物。pH：6.5~~8.5离子强度度：在一定范范围内，，离子强强度大，，IC形成快；；离子强强度过低低或无电电解质存存在，则则不易出出现可见见的沉淀淀反应。。3.增浊剂的的使用为了提高高抗原抗抗体复合合物的形形成速度度，常常常要加入入增浊剂剂，如分分子量为为6000～8000的3%～4%聚乙二醇醇（PEG）或吐温-20（tween-20），以消除蛋蛋白质分分子周围围的电子子云和水水化层，，促进抗抗原抗体体结合。。但PEG浓度过高高，分子子量过大大会引起起血清中中其他蛋蛋白质（（如IgM、α2巨球蛋白白、脂蛋蛋白）非非特异性性沉淀，，形成伪伪浊度。。因此，，使用恰恰当的增增浊剂，，合适的的浓度是是准确测测定所必必须的。4.伪浊度非抗原抗抗体特异异性结合合形成的的浊度，，称为伪伪浊度，，可导致致抗原检检测结果果假性升升高。伪伪浊度形形成的原原因包括括①混浊浊标本、、高血脂脂标本、、反复冻冻融标本本；②抗体效价价低（<1:20）、抗血血清灭活活处理、、抗血清清含有交交叉反应应性抗体体等；③增浊剂PEG浓度过高高；④抗血清细细菌污染染和变质质；⑤器材尤其其是比色色杯不清清洁、尘尘埃污染染等；⑥缓冲液液的离子子强度太太高，pH和温度不不适合等等，都对对浊度产产生影响响。5.标准准曲线制制备与质质量控制制应用仪器器规定的的标准品品制备剂剂量-反应曲线线，一般般采用5点或6点定标，，然后选选择适当当的数学学方法进进行曲线线拟合；；每更换一一批试剂剂，应重重新制备备剂量-反应曲线线。为为保证证结果准准确可靠靠，选取取合适的的质控血血清，每每次开机机进行室室内质量量控制是是极其必必要的。。根据全自自动酶联联免疫分分析系统统的处理理模式，，人们通通常将全全自动酶酶免分析析仪分成成二类，，一类为为分体机机，一类类为连体体机。分分体机是是由“前前处理系系统”即即全自动动样本处处理工作作站和“后处理系系统”即即全自动动酶免分分析仪两两个独立立的部分分组成。。连体机机是由多多个模块块组成，，使用一一台计算算机、一一套操作作系统实实现了从从标本稀稀释、加加样到酶酶标板孵孵育、洗洗涤、加加试剂、、再孵育育、洗涤涤、读数数和结果果打印全全自动进进行。自动化酶酶联免疫疫分析系系统全自动酶酶免分析析仪可对对6～30块板酶标标板同时时进行工工作，具具有一套套完整的的工作和和分析系系统，不不同的仪仪器大小小不同、、配置不不同，但但性能基基本相同同。1.条形码识识别系统统2.样本架和和加样系系统3.试剂架4.温育系统统5.液路系统统6.洗板系统统7.酶标板读读数仪8.自动装载载传递系系统9.计算机管管理和信信息系统统仪器评价价全自动酶酶免分析析仪中的的连体机是将样本本处理工工作站和和全自动动酶免分分析仪联联合起来来，工作作速度快快