裂解加热-荧光毛细管法快速测定血液红细胞内丙酮酸

裂解加热-荧光毛细管法快速测定血液红细胞内丙酮酸周朗1李乔婧1李永生2012-03-09收稿;接受2012-03-09收稿;接受*E-mail:lysgxf2005@;li-yongsheng@1(四川大学化学工程学院，成都610065)2(四川大学基础医学与法医学院，成都610065)摘要在常规红细胞处理方法中，用生理盐水对红/白细胞清洗分离会导致细胞内丙酮酸外渗，造成丙酮酸测定值不能反映细胞内丙酮酸的真实浓度。本研究设计了“氯化铵裂解液特异性裂解红细胞-离心分离白细胞/血小板-加热去除蛋白-丙酮酸酶荧光毛细管分析”方法。经优化后得到的血样预处理条件是：以16000r/min离心血液1min，获得红细胞；裂解液裂解红细胞后在100℃下加热5min。对比实验发现，本方法优于其它红细胞处理法。本研究中丙酮酸测定方法的线性范围为10~120mol/L，检出限为0.98mol/L，灵敏度为5.64FL/mol，高于文献方法60倍以上；测定红细胞内丙酮酸值的相对标准偏差小于2.8%(n=11)，回收率在98.3%~104.1%关键词酶荧光毛细管分析;丙酮酸;红细胞;裂解加热法1引言丙酮酸（Pyruvicacid，PA）在糖类、蛋白质、脂肪的代谢中作为中间产物发挥着重要的作用[1]，许多疾病都与PA含量的异常密切相关[2]。红细胞丙酮酸（Pyruvicacidinerythrocytes,PAE）的测定对一些疾病的早期诊断有指导意义，如糖尿病、心功能不全、肾功能衰竭[3]、自然流产、中毒[4]，遗传性口形红细胞增多症[5]等。Horiguchi等[3]采用高渗法研究PAE，即用生理盐水清洗红细胞后，加入高浓度NaCl溶液使胞内PAE渗出，采用分光光度法测定其浓度；Markuszewski等[6]将红细胞清洗后用去离子水裂解，经煮沸、离心，得到的上清液经超滤后，采用毛细管电泳-紫外光度法测定了PAE含量。此两种方法的不足是滤膜成本高、离心时间长、重现性差、灵敏度低。随后，Ogasawara等[7]改进前述方法，在超滤液中用三氯乙酸沉淀残余蛋白，上清液中PA经丹磺酰肼荧光标记后用HPLC-荧光光度法进行了分离、测定。但该方法仍有测定成本高、荧光标记用时长(约1h)的缺点。荧光毛细管分析法(Fluorescencecapillaryanalysis,FCA)是一种新的微量测定法[8~10]，其优点是试剂和试样的耗量极少(约10µL)、测定成本低、灵敏度高、操作简单等[11~13]。本研究将此FCA法用于微量血中红细胞内微量PA的测定。同时，利用此方法考察了清洗对于PAE测定的影响，并采用裂解加热法消除了此影响，建立了裂解加热-荧光毛细管法快速测定血液红细胞内丙酮酸。2实验部分2.1仪器与试剂RF-5301PC荧光光度仪(日本岛津公司)、AUW120D电子天平(0.01mg，日本岛津公司)，干式恒温器(杭州奥盛公司)，高速离心机TGW-12(长沙英泰公司)，AmiconUltra-15离心超滤管（NMWL10kDa,Millipore公司），毛细管精密定制座[8,14](13mm×13mm×34mm,自制)。乳酸脱氢酶(LDH,EC7，Sigma公司)；还原型辅酶I(NADH)、丙酮酸钠(厦门星隆达公司)；乙二胺四乙酸二钾（K2EDTA）、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、氯化铵（NH4Cl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、氯化钠（NaCl）、偏磷酸（HPO3）、氟化钠(NaF)、三羟甲基氨基甲烷(成都科龙公司)；碘乙酸（阿拉丁公司），所有试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(电导率<0.065S/cm)。2.2血样的预处理采集图1.裂解加热法流程Fig.1.Theprocessofthelysingheatingmethod空腹时人的静脉血，置于冰浴的抗凝管中（1mL血液含1.5mgK2EDTA、2mgNaF和2mg图1.裂解加热法流程Fig.1.Theprocessofthelysingheatingmethod裂解加热处理过程见图1。从抗凝管中取500L血样，以16000r/min离心1min，弃去血浆；吸取红细胞100L，移入含900L红细胞裂解液[15](1.5mol/LNH4Cl,100mmol/LNaHCO3,10mmol/LNa2EDTA,pH7.4)的EP管内混匀、静置2min；以16000r/min离心1min，使白细胞和血小板沉至底部；吸出红细胞溶出液（上清液）900L在100℃下加热5min，使蛋白变性，再以16000r/min离心1min，使变性蛋白沉淀；取上清液，即得到红细胞样品。上述方法简称为裂解加热法(Lysing-heatingmethod,LHM)2.3PAE的酶荧光毛细管分析法(Enzyme-fluorescencecapillaryanalysis,E-FCA)PA在LDH催化下与荧光物质NADH反应，生成乳酸和无荧光的氧化型辅酶I，PA浓度与荧光猝灭量(F)成正比；通过检测F，间接定量分析样品中PA浓度[11]。取上述红细胞样品100L，与100L荧光反应液[13]（0.12mmol/LNADH+200U/LLDH+5mmol/LNa2EDTA+Tris-HCl,pH7.5)混匀，同时，另取100L红细胞样品，与100L荧光空白液(0.12mmol/LNADH+5mmol/LNa2EDTA+Tris-HCl,pH7.5)混合，两种溶液在38℃下反应10min后，吸入毛细管内，在激发/发射波长为350/460nm的条件下，分别测得反应荧光强度值(F)和空白荧光强度值(F0)；根据F=F0-F定量分析PAE3结果与讨论3.1各种因素对PAE测定的影响3.1.1离心转速和时间的影响离心转速和时间影响红细胞压实程度，进而影响红细胞吸取体积的准确性，本研究优选了抗凝血的离心条件。将血样在3300~16000r/min下离心7min，考察了离心转速对PAE测定的影响(图2A)，当转速从3300r/min增大至9300r/min，测定的PAE值随之增加；其原因是随着离心速度增加，红细胞沉降速度加快，细胞压实程度增高，单位体积含红细胞数量增多，因此，PAE的测定值变大；当离心速度大于9300r/min时，PAE的测定值趋于恒定；说明离心分离达到一定速度后，红细胞的沉积量不再变化。因为在同样的离心效果下，红细胞的离心速度与其沉积时间成反比，所以为了缩短离心时间，最终选择离心转速为16000rpm。接着，在此转速下，考察了离心时间(0.5~2.5min)的影响。其结果见图2B。从图可知，随离心时间增加，测得的PAE值不变；这说明在给定转速下红细胞离心时间大于0.5min就可使其完全沉积、压实。为保证离心效果，本实验选择此时间为1min。图2各种因素对红细胞PA测定的影响Fig.2.EffectsofvariousfactorsondeterminationofPAinerythrocytes3.1.2加热温度和时间的影响由于红细胞溶出液中含有的蛋白能导致荧光猝灭，因此，在上述选定的离心条件下，考察了蛋白的去除方法。其过程是，分别在不同温度(60、70、80、90和100℃)下加热红细胞样品5min，使其中的蛋白和其它干扰物质变性，测定上清液与荧光空白混合液的荧光强度，根据荧光强度评价其干扰程度，结果见图2C。实验表明，在混合液放置3、9和15min后，其荧光强度均随红细胞溶出液加热温度升高而增强，直到90图2各种因素对红细胞PA测定的影响Fig.2.EffectsofvariousfactorsondeterminationofPAinerythrocytes在此温度下考察了加热时间对干扰物的除去程度。由图2D可知，在混合液放置3、9和15min后，荧光强度随红细胞溶出液加热时间的延长而升高，4min后不再变化。为确保蛋白和干扰物质完全变性，选取该加热时间为5min。3.1.3清洗的影响为除去红细胞中混杂的白细胞、血小板及少量血浆，常规方法是用生理盐水对其进行多次清洗和离心分离；但此过程是否影响PAE浓度的准确测定尚未见报道。在选定条件下，对生理盐水(0.9%NaCl)清洗红细胞过程进行了考察。分别对3个血样进行清洗,得到的结果见图2E。可以看出，随清洗次数增加，测得的PAE浓度逐渐降低；用磷酸盐缓冲液(pH7.4)进行清洗也得到了相同的结果。这说明生理盐水(或磷酸盐缓冲液)清洗红细胞会造成PAE丢失，这可能是由于生理盐水会导致PAE渗出细胞外。为证明此点，又考察了清洗过程中红细胞内外PA浓度的变化规律。将红细胞加入9倍体积的生理盐水，混匀，每间隔1min取出1mL离心，分别测定其上清液和下层红细胞中的PA(上清液在100℃加热5min后离心检测)。图2F显示，在浸泡过程中，随红细胞浸泡时间增加，2个血样的PAE逐渐减少，细胞外PA不断增加，4min后细胞内外浓度达到平衡。其原因是，在质子势能和PA的电化学势能的推动下，红细胞膜上存在单羧酸转运蛋白协助PA由细胞内向外渗透、扩散[16]。因此，图3.不同红细胞处理方法结果的比较图3.不同红细胞处理方法结果的比较Fig.3.Comparativeresearchofdifferenttreatmentmethodsonerythrocytes.为了选择一种最佳的红细胞处理方法，将文献中的高渗法[3]、酸裂解法[17]、超滤法[6]与本方法在不清洗红细胞的条件下进行了比较。结果表明，高渗法测得的3个血样的PAE值明显小于LHM。这是因为高渗法细胞内外PA达到平衡时内液浓度大于外液，导致测得结果偏小（图3A）。图3B是酸裂解法的对比结果。理论上，由于酸裂解法不是选择性地只破碎红细胞，所以应该是测定的PAE偏高，但测定结果表明，酸裂解法与LHM相差不大。这可能是由于NaOH中和偏磷酸过程中生成大量水、导致溶液体积增大、PAE浓度变小的缘故。图3C是超滤法与LHM的对比结果。超滤法使用离心超滤(3000×g离心20min)除去红细胞溶出液中的蛋白，得到滤液，用于PAE测定。两种方法测定结果一致。这证明，LHM中的高温加热步骤不会导致PAE发生变化。综合比较发现:高渗法测得PAE值偏低;酸裂解法存在白细胞/血小板被裂解等问题;超滤法存在超滤膜成本高、离心时间长的缺点;而LHM避免了前述的不足，省略了清洗/分离步骤，在裂解液特异性裂解红细胞的同时能完全清除掉白细胞和血小板，而且，LHM采用的高速离心使得红细胞高度压实，其残留血浆量显著减少。因此，最终选用LHM用于血液预处理。3.3重现性采用LHM方法对两个血样进行预处理后，用E-FCA法对其进行了测定；得到的PAE值分别为（3.26±0.09mmol/L(RSD<2.75%,n=11)，（2.74±0.07）mmol/L(RSD<2.65%,n=11)。结果表明，此处理方法的重现性良好。3.4干扰实验为了考察E-FCA对PAE的选择性，将共存物质与标准PA溶液混合后观察其干扰情况。当PA浓度为50μmol/L时，10倍的Fe3+，40倍的Ca2+，100倍的Zn2+和Cu2+，200倍的酮戊二酸、300倍的Mg2+、Vc、NAD+，500倍的NH4+、K+、葡萄糖、甘氨酸，均不干扰PA的测定。3.5实际样品PAE测定及回收率实验测定10~120mol/LPA标准溶液，根据实验数据，经数学回归得其线性方程为ΔF=5.64c+2.89(r=0.9999)，灵敏度为5.64FL/mol；经计算得到本方法的检出限(CL=3S/K)为0.98mol/L。本方法的灵敏度高于文献[4,7]方法60取红细胞样品与PA标准溶液等体积混合，加入荧光反应液，反应后按2.3节进行测定，根据线性方程定量分析PAE,结果见下表，回收率为98.3%~104.1%，说明本方法准确、可靠。样品浓度Sampleconc.(after2timesdilution)/μmolL-1添加浓度Addedconc.（μmol/L）回收浓度Recoveredconc.（μmol/L）回收率Recovery/%13.210.010.1101.115.015.2101.420.019.999.411.710.09.898.515.014.798.320.020.8104.16.310.010.1101.215.015.1101.020.020.3101.64结论实验表明：用生理盐水清洗/分离红细胞会导致PAE外渗，造成其测定值偏小，因此在PAE测定时不能清洗红细胞。为除去红细胞中白细胞/血小板等杂质,本研究采用LHM法，结合E-FCA法，实现了PAE的准确测定。本方法的特点是血样用量少、操作简单、成本低廉、测得PAE值准确，为PAE研究和临床检验提供了一种可靠方法。References[1] 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