抗生素类药物的分析

关于抗生素类药物的分析第1页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素代表药物

Aminoglycosids第2页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四一、化学结构与性质链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺1.链霉素

第3页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2.巴龙霉素

巴龙胺+巴龙二糖胺巴龙胺(苷元)巴龙二糖胺(糖)第4页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四3.庆大霉素

绛红糖胺+2-脱氧链霉胺+加洛糖胺

庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3

庆大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

庆大霉素C1aR、R1、R2=H

庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H主要成分第5页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四奈替米星（netilmicin）脱氧链霉胺（氨基糖）绛红糖胺（氨基糖）加洛糖胺第6页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四★理化性质结构相似理化性质相似1.溶解度与碱性碱性:碱性中心链霉素3个庆大霉素5个多与硫酸成盐溶解性:水溶性多羟基化合物易溶于水，不溶于乙醇、氯仿。2个强碱性胍基（PKa=11.5）1个甲胺基（PKa=7.7）第7页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2.旋光性结构中氨基糖的手性碳原子.庆大霉素、巴龙霉素等均有旋光性。硫酸庆大霉素硫酸巴龙霉素硫酸卡那霉素50mg/ml水溶液第8页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四结合较弱结合较强3.苷的水解与稳定性第9页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四链霉素——pH5～7.5时稳定过酸过碱则水解。庆大霉素、奈替米星——对光、热空气均稳定。水溶液pH2～12时稳定。4.紫外吸收庆大霉素、奈替米星等无UV吸收第10页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四★★(二)鉴别试验1.茚三酮反应ChP：硫酸庆大霉素、硫酸核糖霉素氨基糖苷结构具有羟基胺类和α—氨基酸的性质△+第11页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2.Molisch试验

五碳糖和六碳糖的特征反应五碳糖氨基糖苷化合物六碳糖氨基糖苷化合物H+浓H2SO4/HClα-萘酚/蒽酮红紫色或蓝紫色硫酸核糖霉素

0.1%蒽酮/浓H2SO4蓝色→蓝绿色第12页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四红紫色羟甲基糠醛(含六碳糖结构氨基糖苷类酸性水解产物)蓝紫色第13页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应★★链霉素水解产物反应第14页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四N—甲基葡萄糖胺反应(Elson—Morgan反应)乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色

第15页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四(缩合)第16页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四红色对二甲氨基苯甲醛H+第17页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四例硫酸新霉素Ch.P（2010）

【鉴别】（1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9→100）2ml，在水浴中加热10分钟，加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色。第18页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四麦芽酚反应——链霉糖特有反应分子重排六元环脱N—甲基葡萄糖胺脱链霉胍H+硫酸铁铵H+

Fe3+分子重排麦芽酚第19页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四第20页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四坂口反应（Sakaguchi反应）链霉胍特有反应（或α-萘酚）加入尿素使颜色稳定可比色测定硫酸链霉素0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1％的8—羟基喹林的乙醇溶液1ml，放冷至约15℃，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。第21页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四坂口反应+OH-第22页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四硫酸盐反应H+TLC法——硫酸链霉素和硫酸庆大霉素鉴别[色谱条件特点]：吸附剂:硅胶展开剂：氯仿—甲醇—浓氨水显色剂：茚三酮或碘蒸气第23页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四HPLC法鉴别BP硫酸庆大霉素据色谱图中庆大霉素C1、C2

、C1a、C2a的保留时间鉴别。光谱法鉴别1.IR——ChP鉴别妥布霉素

USP鉴别硫酸庆大霉素。2.UV——BP硫酸庆大霉素饱和结构240—330nm无吸收第24页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四例【鉴别】HPLC法Ch.P（2010）

硫酸依替米星硫酸卡那霉素硫酸小诺霉素硫酸奈替米星硫酸阿米卡星硫酸庆大霉素硫酸西索米星硫酸巴龙霉素妥布霉素第25页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四三、特殊杂质检查及组分分析（一）链霉素杂质链霉素B（甘露糖链霉素）活性低来源：反应中间体残留TLC（对照品法）BP（2000）甘露糖链霉素D-甘露糖对照品D-甘露糖水解TLC展开、显色，比较(﹤3.0%)方法：HPLC法(ChP2010)第26页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四(二)、硫酸奈替米星中的有关物质检查特殊杂质：西梭米星来源：合成原料残留方法：TLC对照品法与高低浓度对照法同时控制杂质限量★(三)、庆大霉素C组分的测定C组分比例不一致发酵菌种不同工艺差别第27页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四对微生物的活性无明显差异不同的C组分毒副作用和耐药性不同ChPJPBPUSP规定控制各组分的相对百分含量方法：柱前衍生化—离子对HPLC法庆大霉素无UV吸收Gentamycin-NH2+

OPA+HSCH2COOHλmax=330nm第28页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物λmax=330nm第29页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四HPLC条件色谱柱：ODS流动相：水—冰醋酸—甲醇(25:5:70)配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液检测波长:330nm计算:峰面积归一化法规定

C120~40%C1a10~30%C2a+C2b+

C240~60%第30页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四庆大霉素C组分的测定实验条件的讨论1、OPA的作用是什么？2、冰醋酸的作用是什么？3、庚烷磺酸钠的作用是什么？第31页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四（四）硫酸盐测定剩余滴定法空白滴定第32页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四四、含量测定1.免疫分析法2.微生物检定法（各国药典普遍采用）利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。第33页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四3.HPLC法优点:高灵敏度、专属性广泛应用于抗生素稳定性研究及体内分析氨基糖苷类一般无吸收柱前(后)衍生化【含量测定】

Ch.P规定方法

微生物检定法

盐酸大观霉素，硫酸新霉素，硫酸链霉素，硫酸核糖霉素，硫酸奈替米星，硫酸阿米卡星，硫酸庆大霉素，硫酸西索米星，硫酸巴龙霉素，硫酸小诺霉素

HPLC法

硫酸依替米星，硫酸卡那霉素第34页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四生物样品中氨基糖苷类分析的原则1、OPA、FMOC-Cl、FDNB柱前衍生化反应重要意义：2、样品预处理：（1）离子对试剂（2）固相萃取柱3、柱前衍生化反应是否完全需要考查第35页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四第四节四环素类抗生素结构上具有氢化骈四苯环，统称为四环素族抗生素一、基本结构与化学性质化学结构:四骈苯或萘骈萘的衍生物。取代基不同而构成不同的四环素.name

R R’R’’

R’’’四环素 TC

H OH CH3H金霉素 CTC Cl OHCH3H土霉素 OTC

H OH CH3OH脱氧土霉素 DOTCH H CH3OH第36页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四

多西环素（DOTC）

（doxycycline）（脱氧土霉素）（强力霉素）第37页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四A环B环C环D环二甲氨基—N(CH3)2酚羟基酰胺基—CONH2酮基与烯醇基共轭双键系统酮基与烯醇基共轭双键系统第38页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四★结构特点与分析方法之间的关系1.共轭双键，刚性结构：具有紫外吸收，可产生荧光，可进行鉴别和含量测定。

2．具有酚羟基、烯醇基：可发生三氯化铁反应、可与金属离子络合，用于鉴别。

3.具有手性碳原子：具旋光性，用于鉴别。第39页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四理化性质1.酸碱性与溶解度两性:酚羟基、烯醇羟基弱酸性二甲胺基弱碱性1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度↑3.游离组分在水中溶解度很小溶解度:第40页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2、含结晶水四环素：6个结晶水占19.6%土霉素：2个结晶水占7.5%加热时可失去结晶水,当含水量低于19.6%的四环素和低于7.5%的土霉素,置于空气中要吸收水分第41页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2.旋光性——用于鉴别、定量分析ChP—盐酸土霉素：-188°～-200°

盐酸四环素：-240°～-258°3.UV吸收和荧光共轭双键系统：具有紫外吸收，可产生荧光降解产物的荧光可供鉴别用。土霉素绿色荧光；金霉素蓝色荧光；四环素黄色荧光H+OH-第42页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四4.与金属离子形成配位化合物酚羟基、烯醇基的性质。Ca2+Mg2+Fe3+Al3+等pH3~7.5强烈荧光第43页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四5.不稳定性:水溶液对酸、碱、氧化剂均不稳定。1）差向异构化淡黄→黑蓝色荧光土霉素、多西环素不易差向异构化第44页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四A环上手性C4构型的改变差向四环素第45页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四（土霉素、多西环素不易差向异构化）第46页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四多西环素不发生（C环无羟基）第47页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四（2）碱性下降解（荧光）多西环素不发生第48页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四～～TCETCATCEATC＜＜差向脱水差向脱水第49页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四★二、鉴别试验1.浓H2SO4反应2.FeCl3反应酚-OH反应氧化、脱水第50页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四3.TLC法正相分配薄层色谱——对照品法载体：硅藻土（中性）+EDTA展开剂：乙酸乙酯-氯仿-丙酮(2:2:1)+EDTA显色：UV：365nm荧光ChP，BP方法克服痕量金属造成的拖尾现象4.HPLC法ChP，USP方法保留时间鉴别（pH7）盐酸土霉素，盐酸金霉素，盐酸多西环素，盐酸美他环素第51页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四5.荧光反应：四环素类在紫外灯下产生荧光，其降解产物也具有荧光，可供鉴别。UV绿色荧光H+UV第52页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四6.UV法溶剂:1mol/L盐酸-甲醇（1→100）浓度:0.01mg/ml第53页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四三、特殊杂质检查1.有关物质4-差向四环素（ETC）<4.0%脱水四环素（ATC）<0.5%差向脱水四环素（EATC）<0.5%盐酸金霉素（CTC）<1.0%引起失效，中毒！降解产物及异构杂质,。可引起恶心、呕吐、糖尿、蛋白尿及酸中毒，称为Fanconi症侯群第54页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四HPLC法（ChP版）加校正因子的自身高低浓度对照法定量以吸收系数比作为校正因子2.杂质吸收度ETC、ATC等杂质为深色物质含量越高，A杂质越大ChP/BP规定杂质吸收度限量第55页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四杂质吸收度第56页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四四、含量测定JP比色法ChP、USP——HPLC法（外标法）盐酸四环素的含量测定色谱柱：ODS（pH适应值范围>8）流动相：pH8.3的碱性溶液系统适用性试验

4-差向脱水四环素四环素第57页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四中国药典规定用HPLC法测定的四环素类药物盐酸四环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸多西环素盐酸美他环素第58页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四五、高分子杂质的检查（了解）内源性：药物自身聚合物来源于生产过程、贮存过程、使用不当外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物来源于发酵过程高分子杂质凝胶色谱法：葡聚糖凝胶SephadexG-10杂质控制方法控制重点!第59页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四1.基本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应侧链参于反应头孢菌素族与母核有关的N型聚合反应侧链参与反应的L型聚合反应第60页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2.特点（1）发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，形成青霉素噻唑多肽类杂质。（2）有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合物发生不同程度的降解作用。（3）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。（4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）第61页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四第62页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四1、下列哪个药物会发生羟肟酸铁反应

A.青霉素

B.庆大霉素

C.红霉素

D.链霉素

E.维生素C第63页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四2、中国药典测定头孢菌素类药物的含量时，最多采用的方法是

A.微生物法

B.碘量法

C.汞量法

D.正相高效液相色谱法

E.反相高效液相色谱法第64页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四3、属于-内酰胺类的抗生素药物有

A.青霉素

B.红霉素

C.头孢菌素

D.庆大霉素

E.四环素第65页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四4、能和茚三酮发生呈色反应的物质有

A．链霉素

B．庆大霉素

C．土霉素

D．氨基酸

E．苯巴比妥第66页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四6、能发生重氮化-偶合反应的抗生素类药物是

A.青霉素

B.庆大霉素

C.苄星青霉素

D.盐酸四环素

E.普鲁卡因青霉素第67页，共73页，2022年，5月20日，22点0分，星期四7、四环素在酸性条件下的降解产物是

A.差向四环素

B.脱水四环素

C.异四环素

D.去甲四环素

E.去甲氧