实验版MTT主题知识讲座

细胞毒理学试验技术MTT法检测细胞活性实验版MTT主题知识讲座第1页掌握MTT法检测细胞活性基本原理和操作步骤了解MTT法检测应用了解数据处理和统计分析基本方法。实验目实验版MTT主题知识讲座第2页MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一个黄颜色染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功效。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中甲瓒，用酶标仪在490nm波优点测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成量与细胞数成正比。依据测得吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（假如是测药品毒性，则表示药品毒性越小）。试验原理实验版MTT主题知识讲座第3页仪器与试剂仪器：二氧化碳培养箱、酶标仪、超净工作台、倒置相差显微镜等。耗材：培养皿、96孔板等。试剂：PBS（Nacl8g、Kcl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g、调pH7.4）MTT，浓度为5mg/ml。称取MTT0.5克，溶于100ml磷酸缓冲液（PBS）或无酚红培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里细菌，放4℃避光保留即可，两周内有效，或配制成5mg/ml保留在-20度长久保留，防止重复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。丝裂霉素C，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125，单位μg/ml，溶解于无血清培养基中。DMSO,1640培养基。实验版MTT主题知识讲座第4页试验步骤第一天消化细胞，接种至96孔板，调整浓度至1x104个/ml每孔接种100μl(空白对照组不接种细胞)第二天加入药物丝裂霉素C，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125，单位μg/ml。每孔100μl。第三天（24h）加MTT,4h后加入DMSO检测（保留原培养液，5μg/mlMTT每孔加10μl）实验版MTT主题知识讲座第5页试验流程：接种细胞取出培养细胞，镜检加入0.25%胰酶消化30s-1min，弃掉胰酶。加入含血清RPMI1640/DMEM共3ml终止消化，并充分吹打细胞。吹打混匀后，取100μl进行细胞计数，根据计数结果，调整细胞终浓度至1x104个/ml，接至96孔板贴壁培养，每孔100μl细胞悬液。实验版MTT主题知识讲座第6页96孔板接种方案A1空白A2空白A3空白A4空白A5空白A6空白A7空白A8空白A9空白A10空白A11空白A12空白B1对照B2对照B3对照B4对照B5对照B6对照B7对照B8对照B9对照B10对照B11对照B12对照C1浓度1C2浓度1C3浓度1C4浓度1C5浓度1C6浓度1C7浓度1C8浓度1C9浓1C10浓度1C11浓度1C12浓度1D1浓度2D2浓度2D3浓度2D4浓度2D5浓度2D6浓度2D7浓度2D8浓度2D9浓度2D10浓度2D11浓度2D12浓度2E1浓度3E2浓度3E3浓度3E4浓度3E5浓度3E6浓度3E7浓度3E8浓度3E9浓度3E10浓度3E11浓度3E12浓度3F1浓度4F2浓度4F3浓度4F4浓度4F5浓度4F6浓度4F7浓度4F8浓度4F9浓度4F10浓度4F11浓度4F12浓度4G1浓度5G2浓度5G3浓度5G4浓度5G5浓度5G6浓度5G7浓度5G8浓度5G9浓度5G10浓度5G11浓度5G12浓度5H1浓度6H2浓度6H3浓度6H4浓度6H5浓度6H6浓度6H7浓度6H8浓度6H9浓度6H10浓度6H11浓度6H12浓度6第一试验小组第二试验小组第三试验小组第四试验小组第五试验小组第六试验小组实验版MTT主题知识讲座第7页试验流程：MTT检测培养24小时后，取出96孔板。每孔加入5mg/ml的MTT10μl，混匀，继续反应4h。4h后，将每孔中的培养液完全吸取干净，再加入DMSO，每孔100μl，振荡10min。酶标仪检测490nm光吸收值。实验版MTT主题知识讲座第8页试验结果及处理1、将光吸收值数据输入EXCEL实验版MTT主题