课题6 血红蛋白的提取和分离(学案)

第第18页一、达标

省海中高二生物（选修）教学学案课题6 血红蛋白的提取和分离

（） 混合物上柱；（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。（一）知识目标知识与技能:1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理进程与方法:体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意依照操作提示进行相关步骤情感态度与价值观:初步形成科学的思维方式，发展科学素质和人文精神重点:重点:凝胶色谱法的原理和方法难点:样本的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填二、基础知识生物体内的进程，必需保持体外的pH与体内的基本一致。思考：说出人体血液中缓冲关于？思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？（一）原理1．凝胶色谱法3．电泳（1）概念：电泳是指。凝胶色谱法也称做 是根据 分离蛋白质的有效方法。原理许多重要的生物大分子（ 等都具（）凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相在（ ）下，这些基团会带上（）。在电

不同的蛋白质分子完全分开；的蛋白质行程较短已从 中洗脱出来， 蛋白质还在行进中。2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的生物体内进行的各种生物化学反映都是在一定的下进行的，例如：血浆的是 ，要在实验条件下准确模拟关于分子质量不同的蛋白质分子经过凝胶时速度不同，相关于分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相关于分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相关于分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。具体进程：相关于分子质量较小的蛋白质凝胶颗粒相关于分子质量孔较大的蛋白质 多孔板AB的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速经过

场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）移动。电泳利用了待分离样本中各种分子（ ）以及分子本身（ （ 的不同使带电分子产生不同（ 从而实现样本中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁率取决于 以及 等因素。蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 怣耉ⅹ昵听扆朏秓粁皊蛑皃贮皊揖叜咒刌私鄃昵迟栽皊‐乀仆乎‐样本处理血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是，血红蛋白有个肽链组成，囊括 ，其中每条链环绕一个，磁基团可携带 。血红蛋白因含有呈现红色。红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要即时采用 分离红细胞然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短间离心，如此反复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。透析 取的血红蛋白溶液装入 中将透析袋放入盛有的物质的量的浓度为的 中透析透析可以去除样本中 的杂质，或用于更换样本的 。凝胶色谱操作第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质路程较长，移动速度较慢 路程较长，移动速度较快路程较短，移动速度较慢 路程较短，移动速度较实验操作样本处理红细胞的洗涤①目的：去除（ ）②方法（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴胞等一同沉淀达不到分离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ，将下层（ ）的红细胞液体倒入（）再加入用（ ）的（）⑤低速离心（低速短时间）⑥反复、5步骤（ ）次，直至上清液中已没有（ ，表明洗涤干净利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。血红蛋白的释放加（ ）到（ ）体积，再加％体积的（ 置于（ ）上充分搅拌分钟（加速细胞破裂细胞破裂释放出血红蛋白．的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:第1层（最上层（ ）甲苯层

第4层（最下层：其它杂质（ ）的沉淀层透析凝胶色谱制作凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1．6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ 在l（ ）头部切下（ 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。剪尼龙网小圆片覆盖（ 上（ 的尼龙纱将橡皮（ ）包好，插到玻璃管一端。、色谱柱下端用移液头部做（ ，连接一细的（ ，并且用螺旋夹控尼龙管的（ ，另一端放入收集（ ）的收集器内③顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。凝胶色谱柱填料的处理凝胶的选择（ 。方法：配置凝胶悬浮液：计算并且称取一定量的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后，配成（ 。凝胶色谱柱的装填方法①固定：将色谱柱处治固定在支架上②装填：将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（ ）高的操作压下，用的的磷酸缓冲液为充分（ 小时。样本加入与洗脱加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口加透析样本①调整缓冲液面：与凝胶面平齐2层（中上层（）（）色薄层固体②滴加透析样本：用（l）3层（中下层（）的水溶液层（）的液体③样本渗入凝胶床（）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液每（ ）收集一试管连续收集思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点关于你进行蛋白质的分离有什么意义？思考：你能描述血红蛋白分离的完整进程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步囊括样本处理粗分离纯化和纯度鉴定。首先经过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样本的处理再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ；然后经过凝胶色谱法将相关于分子质量较大杂质蛋白除去即样本（ 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进（ 。－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度电泳方法步骤根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 聚丙烯酰胺凝胶制备样本处理： 把凝胶固定于电泳装置上加样：按顺序加样，加样量通常为红细胞破碎后（即进行凝胶色谱分离之前）的样本和凝胶色谱分离之后的样本电泳 剥胶 染色 脱色 观察结果SS电泳的成功关键之一是电泳进程中，待别是样本制备进程中蛋白质与SS的接合程度。三实验结果分析与评判观察血液样本离心后是否分层，如果分层不鲜明，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速渡过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。讨论：如何测定蛋白质的分子量？蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的关于数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。四、突破训练一．选择题凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。分子的大小 相关于分子质量的大小带电荷的多少 溶解度

缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。温度 渗透压 氧气浓电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。相同 相反 相关于 相向哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。血红蛋白 肌红蛋白 肌动蛋白 肌球蛋血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。白细胞 血小板 红细胞 淋巴细为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂甲苯 蒸馏水 柠檬酸钠43层是无色透明的甲苯层 脂溶性物质的沉淀层血红蛋白的水溶液 其他杂质的暗红色沉淀凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是分子的大小 相关于子质量的大小带电荷的多少 溶解度利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是相关于分质量大的 溶解度高相关于分子质量小的 所带电荷多的凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是糖类合物 脂质 蛋白质 核酸相关于分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行进程可表示为图中哪一个 （ ）用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质路程较长，移动速度较慢 路程较长，移动速度较快路程较短，移动速度较慢 路程较，移动速度较能进入凝胶内部通道的蛋白质是指相关于分子质量大的 吸附性高的相关于分子质量小的 溶解度低凝胶色谱法中移动得快的是相分子质量大的溶解度高的 相关于分子质量小的溶解度低的缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变温度 渗透压 氧气浓度初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为3一缓冲液 缓冲缓冲液 缓冲液蛋白质提取和分离分为哪几步一聚丙烯酰胺凝胶电泳样本处理、凝胶色谱操作、纯化 样本理、粗分离、纯化、纯度鉴样本处理、纯化、粗分离、纯度鉴定血红蛋白因含有什么物质而呈红色甲苯 血红蛋白水溶液脂性物质的沉淀层 其他杂质的沉淀分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于一 二 三 下列操作正确的是分离红细胞时采用低速长时间离心．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳进程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决电荷的多少 分子的大小肽链的多少 分子形状的差洗涤红细胞的目的是去除血清 去杂蛋白 除去血小板 除去洗涤红细胞时，分离所用的方法为低速长时间离心 低速短时间离心高速长时间离心 高速短时间离一聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入的作用是增大蛋白质的相关于分子质量 改变蛋白质的形状盖不同种蛋白质问的电荷差别 减少蛋白质的相关于分子质制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是移液管头部5移液管尾部5移液管头部3移液管尾部3下列有关凝胶色谱法中样本的加入和洗脱的叙述中，正确的先加入1透析后的样本

B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水在下列哪一种条件下生物大分子具有的可解离的基团会带上正电或负电一定温度 定一定压强 一定容电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是相同 相反 相关于 相向装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应先打开后关闭 B．关闭 先关闭后打开 打开31．亚铁血红素基团可携带一分子一分子一分子或一分子人体正常的血红蛋白中应含有若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的转化为C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反映中亚硝酸盐是还原剂 维生素C是氧化剂亚硝酸盐被氧化 维生素C将还原为加有少量柠檬酸钠（防止血液凝固）依次加入质量分数为后离心。下列叙述中，正确的是①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞试管的沉淀中诀别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞．防止血红蛋白被氧化．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能在盛有红褐色的，胶体的U后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明胶体粒子带正电荷，向阴极移动胶体粒子带负电荷，向阳极移动胶体粒子带正电荷，向阳极移动胶体粒子带负电荷，向阴极移动下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是B．经过透析可以去除样本中分子质量较大的杂质，此为样本的粗提取C．可经过凝胶色谱法将相关于分子质量大的杂质蛋白除去，即样本的纯化．可经过SS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度凝胶色谱法操作正确的是C．插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面．将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片38．样本的加入和洗脱的操作不正确的是下面加样后，打开下端出口，使样本渗入凝胶床内等样本完全进入凝胶层后，关闭下端出口用吸管小心的将透析后的样本加到色谱柱的顶端，不要损坏凝胶面下列说法不正确的是蛋白溶液离心后分为41层为白色薄层固体C．血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物43二、多选题选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是血红蛋白是有色蛋白 红细胞无细胞核红细胞白质含量高 红细胞含量下面关于关于血红蛋白提取和分离的样本的处理措施中，正确的采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白．凝胶色谱柱取长为B．凝胶色谱柱过高超过1m，不影响分离的效果C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样本的稀释渡过大43．下列有关提取和分离血红蛋白的进程的叙述中，正确的是A．样本的处理就是经过一系列操作收集到血红蛋白溶液B．经过透析可以去除样本中相关于分子质量较大的杂质，此为样本的粗提取C．可经过凝胶色谱法将相关于分子质量大的杂质蛋白除去，即样本的纯化．可经过SS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

7血浆蛋白接合后的作用的叙述中，正确的是使其不容易经过肾脏排出 使其不容易进入细胞使其有效浓度处于特定水平 克制雄性激素发挥作下列叙述中的是溶液的浓度只能使溶解而不能使其析出．密封瓶口前最好将瓶口经过火焰以防杂菌污染电泳利用了待分离样本中各种分子 以及 的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样本中各种分子的分离。4层：第一层为 ，第二层固体，的沉淀层，第三层液体，的水液，第四层是其他杂质沉淀物。细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：血红蛋白提取和分离的程度可分为四步、 、 和 。进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的。②以上所述的进程即是样本处理，它囊括、 、收集血红蛋白溶液。收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样本的粗分离。①透析的目的。②透析的原理。然后经过凝胶色谱法将样本进一步纯化，最后经纯度鉴定。①样本纯化的目的。②血红蛋白有什么特点？ 。这一特点关于进行蛋白的分离有什么意义。早在上世纪六十年代，在美国的黄石国家森林公园发现了一种嗜热细菌，从这种细菌中分离提取了一种酶，称为聚合酶。实验得知反映变性时温度为依赖，浓度在能最大限度地激活若要培养嗜热细菌，培养基中应有水、碳源、 、 等养物质。在此基础上，培养该菌时需先将培养基 。若将培养细菌的培养基用于植物组织培养，还应加入 。聚合酶可用于原因是该酶有 ，因此在扩时可以 加入。红细胞的洗涤样本处理红细胞的洗涤样本处理粗分离血红蛋白的释放

目的：去除杂蛋白操作：取血样加抗凝剂低速短时离心用吸管去上层透明的血浆加五倍体积的生理盐水搅拌、低速短时离心

目的：防止血液凝固达不到分离的效果保持红细胞的形态结果：上清液没有黄色，表明红细胞已洗

纯化 凝胶谱法将相关于分质量大的杂质蛋白除去经SS—聚丙烯酰胺凝胶纯度鉴定电泳进行纯度鉴定如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离。时离心离心后试管中溶液分为4层操作：加等体积的蒸馏水将离心管中液体用滤纸过滤加甲苯滤液置于分液漏斗中静止分层置于搅拌器上搅拌10分钟