革兰氏阴性需氧杆菌的检验

1、革兰氏阴性需氧杆菌的检验一、布氏杆菌属（Brucella）布氏杆菌又名布鲁氏菌, 1887年Bruce从死亡士兵脾脏中分到第一株布鲁菌，可引起多种动物发病。主要寄居于肝、脾和淋巴组织的单核细胞，是胞内寄生菌。布氏杆菌属（Brucella）是一类革兰氏阴性短小杆菌，引起母畜传染性流产。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品均可被感染。我国部分地区曾有流行，现基本控制。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。我国主要流行羊(Br. Melitensis)、牛(Br. Bovis)、猪(Br. suis)三种。 （一）形态及染色特性1、G球杆状或细小短杆状；大小0.5-0.

2、70.6-1.5m。多单在，无芽胞、无鞭毛；毒力菌株有菲薄的微荚膜。2、病料或初次分离为球杆状，传代后猪和牛源逐渐变为杆状，而羊源仍呈球杆状。3、常用 柯兹罗夫斯基染色法即柯氏染色法：本菌红色，其他组织细胞与杂菌均呈绿色或兰色。（二）培养及生化特性 1、专性需氧。牛布氏杆菌初次分离需在5-10% CO2，移种几代后不需要CO2。最适温度37，pH6.6-7.2。2、营养要求高，生长时需硫胺素，烟草酸和生物素，泛酸钙等；普通琼脂上生长贫瘠，加马血清、血液、葡萄糖、甘油、胰化酪蛋白大豆胨等可促进本菌生长。实验室常用肝汤琼脂、马铃薯浸汁琼脂、胰蛋白胨琼脂、改良厚氏培养基分离该菌。3、液体培养基上呈轻

3、微浑浊，时间长可形成厚菌膜；固体培养基上有S、 R 、I、 M型菌落，大小不一。固体培养基的菌落特征光滑 (S)型：菌落无色透明、表面光滑湿润、有光泽、透光呈淡黄色及侧光呈现轻微乳色和略带蓝灰色，菌落大小不等，一般直径为0510mm，小者0050.1mm，大者34mm.粗糙 (R)型：菌落不太透明，呈多颗粒状，表面灰暗，颜色由无光泽白色、淡黄白色或浅黄色到褐色，易碎或黏滞不易从培养基表面刮净。有时还可出现浑浊不透明、黏胶状的黏液(M)型菌落。除S、R和M型菌落外，在培养中还会出现这此菌落间的过渡类型，如S+R型菌落间的中间(I)型菌落。 4、菌落特性（1）肝汤琼脂或胰蛋白胨琼脂：培养4d，呈细

4、小、柔软、湿润、圆形、隆起、透明和闪光的露滴状菌落，菌落大小不等，小的0.050.1mm，大的0.51.0mm；（2）血琼脂：灰白、隆起的细小圆形菌落，不溶血; （3）麦康凯琼脂上不能生长; （4）注意：布氏杆菌易发生S-R变异。此菌生长缓慢，48 h后才出现透明小菌落，鸡胚培养也能生长。5、种和生物型该属现包括6个种20个生物型，即马尔他布氏杆菌生物型13、流产布氏杆菌生物型19、猪布氏杆菌生物型15、绵羊布氏杆菌、沙林鼠布氏杆菌和犬布氏杆菌。（三）抵抗力1、自然界中抵抗力较强，阳光直射和干燥条件下抵抗力较弱；在病畜脏器和分泌物中一般能存活4个月，在食品中约能生存2个月。2、对低温抵抗力强，

5、对湿热敏感， 60加热30min或705min即杀死，煮沸立即死亡。 。3、对链霉素、氯霉素和四环素等均敏感。 对一些消毒剂也很敏感对消毒剂的抵抗力也不强，2%石炭酸、来苏儿、烧碱溶液或0.1%的升汞，可于lh内杀死本菌;5%新鲜石灰乳或1%2%福尔马林3h可将其杀死;05%洗必泰或001%度米芬、消毒净或新洁尔灭，5min内即可杀死本菌。在pH5或更低情况下迅速死亡。（四）抗原性及变异性1、属内抗原：（1） 细胞壁表面的脂多糖蛋白复合物，包括A（牛布氏杆菌主要成份）和M（羊布氏杆菌主要成份）两种。牛布氏杆菌（Am）含A 抗原多，含M抗原少。羊布氏杆菌(aM)含A 抗原少，含M抗原多。可用凝集

6、吸附试验制备单因子血清，供菌种鉴定用。（2）细胞壁内部的脂多糖复合物R抗原（不凝集S型菌的A、M抗体）；发生SR变异后，丧失A、M抗原，可暴露R抗原。绵羊种和犬种布氏杆菌是天然R型种，其他种为S型种。布氏杆菌最常见的变异是SR变异，很少发生回变。2、属外抗原：指布氏杆菌能与巴氏杆菌、变形杆菌、弗朗西斯菌、弧菌、弯曲杆菌、钩端螺旋体、假单胞菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌以及大肠杆菌等菌属细菌发生交叉凝集反应的抗原。（五）致病性1、致病因子：不产生外毒素，仅有毒性很强的内毒素LPS。2、感染与致病机理： 本菌侵入机体后，被吞噬细胞吞噬，但本菌的荚膜能抵抗吞噬细胞的裂解，并能在该细胞内增殖，成为细胞内寄生

7、菌。 繁殖到一定数量后，经淋巴管至局部淋巴结，突破淋巴结屏障而进入血流，反复出现菌血症。由于内毒素作用，病人出现发热、无力等中毒症状，以后本菌随血液侵入脾、肝、骨髓等细胞内寄生，血流中细菌逐步消失，体温也恢复正常。 细菌在细胞内繁殖至一定程度时，再次进入血流，出现菌血症，体温再次上升，反复呈波浪热型。 因本菌多为细胞内寄生，难于彻底治疗，易转为慢性及反复发作，从而在全身各处引起迁徒性病变。（六）微生物学诊断布氏杆菌病常表现为慢性或隐性感染，其诊断和检疫主要依靠血清学检查及变态反应检查。细菌学检查仅用于发生流产的动物和其他特殊情况。 本菌传染性大，要注意防止实验室污染。 1、细菌学检查采样：病料

8、最好用流产胎儿的胃内容物、肺、肝和脾以及流产胎盘和羊水等。也可采用阴道分泌物、乳汁、血液、精液、尿液以及急宰病畜的子宫、乳房、精囊、睾丸、附睾、淋巴结、骨髓和其他有局部病变的器官。显微镜检查： 病料直接涂片，作革兰氏和柯兹洛夫斯基染色镜检。若发现革兰氏阴性、鉴别染色为红色的球状杆菌或短小杆菌，即可作出初步的疑似诊断。此法更适合于作流产材料及流产数日月内的阴道分泌物检查。分离培养鉴定：急性期采集血液，慢性期采取骨髓，接种于双相肝浸液培养基(一半斜面，一半液体)，置37 10% CO2中培养，每隔2d检查一次，培养30d无细菌可定阴性。2、变态反应检测不宜作早期诊断。布氏杆菌水解素注射皮肤，观察红

9、肿反应。1-2cm为弱+；2-3cm为+；4-6cm为强+。3、血清学检查可检测血清中布氏杆菌抗体和病料中布氏杆菌。用已知抗体可检查病料中是否存在布氏杆菌，或分离培养物是否为布氏杆菌，比细菌学检查法简便快速，因而具有较大实用价值。常用方法有荧光抗体技术、反向间接血凝试验、间接炭凝集试验以及免疫酶组化法染色等。动物在感染布氏杆菌715d可出现抗体，检测血清中的抗体是布氏杆菌病诊断和检疫的主要手段。方法多，各有所长，目前还没有一种完美的方法。因此在实际工作中，最好用一种以上的方法相互配合。血清学检查：用已知的布氏杆菌检查动物的血清抗体凝集试验（虎红平板凝集试验）感染初期检测。大动物血清凝集价达1：

10、100时阳性，1：50可疑；小动物1：50为阳性，1：25为可疑。补体结合试验：慢性布氏杆菌病诊断。规定1: 10被检血清阻止溶血在50%以上即阳性。凝集反应、补体结合反应和变态反应出现的时间各有特点。即动物感染布氏杆菌后，首先出现凝集反应，消失较早;其次出现补体结合反应，消失较晚；最后出现变态反应，保持时间也较长。在感染初期阶段，凝集反应常为阳性，补体结合反应或为阳性或为阴性，变态反应则为阴性。到晚期慢性或恢复阶段，则凝集反应与补体结合反应均转为阴性，仅变态反应呈现阳性。因此有人主张，为了彻底消除各类病畜，应同时使用三种方法进行综合诊断。微生物学检验二、假单胞菌属（Pseudomonas M

11、igula 1894）G ，直或微弯的杆菌，0.5-1.01.5-5.0m。多单在。不产芽孢。以单极或数根极毛运动，有的种还具短波长的侧毛。严格需氧。不能在酸性下（pH4.5）生长，多数种不需要有机生长因子。化能异养，有的种利用H2或CO为能源兼性化能自养。接触酶阳性, 产生各种水溶性色素。自然界分布极广，土壤、淡海水、污水、动植物体表等均存在。引起疾病(Pseudomonas Disease)的有绿脓杆菌、荧光假单胞菌、鳗败血假单胞菌和恶臭假单胞菌等。（一）铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa ）原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、

12、呼吸道和肠道等都有本菌存在。易从外伤、烧伤及尿道感染的标本分离。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。 1 形态及染色特征铜绿假单胞菌为非发酵革兰氏阴性菌，菌体细长，长短不一， 呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体一端单鞭毛，暗视野或相差显微镜下可见细菌运动活泼。2 生长特性专性需氧，生长温度2542，最适2530，4不生长，42可生长，可用以鉴别该菌。 普通培养基上生长1824h可见扁平、湿润的菌落，能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等，使得培养基呈亮绿色。 血琼脂平板生长可见菌落周围有溶血环，菌落呈金属光泽；液体培养基呈浑浊状生长，液体

13、表面形成菌膜，培养基底部生长不良。 3 生化特点该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖、木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。 液化明胶、可分解尿素，还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气。 吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。4 抗原性与分型该菌含O抗原（菌体抗原）及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。O抗原可用以分型。 （1）噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。 （2）血清学分型：利用O抗原进行分型，目前可分20个血清型。 （3）质粒指纹图分析：此项技术是对同种细菌的不同株进行同源性分析的一种方法。根据细菌携带质粒的

14、情况进行分析。 5 微生物学检查标本采集：采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自环境中的各种标本如水、空气、物体表面等。 涂片镜检: 革兰阴性，菌体大小1.5-5.00.5-1m。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞。 分离培养: 对有正常菌群存在的临床标本或采自环境中的标本应接种选择性培养基: 麦康凯琼脂(MAC)； 对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通或血琼脂培养基。（二）椰毒假单胞菌酵米面亚种 椰毒假单胞菌酵米面亚种（Psedomonas cocovenenans supsp. farino fermentans）是我国发现的一种新的

15、食物中毒菌，它存在于发酵的玉米、糯玉米、黄米、高梁米、变质银耳以及周围环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。该菌产生的毒素米酵菌酸是其致病原因。1 形态及染色特征革兰氏阴性短杆菌，大小为1.5-4m0.5-1.0m，直或微弯的需氧杆菌。细胞呈卵圆、短杆状以至长杆状形态。两端钝圆，无芽胞，有鞭毛。兼性厌氧，但易在表面生长。 胞浆中含浓染颗粒及空泡。在透射电镜下观察,可见异染颗粒、脂质颗粒、板层状内膜结构等特殊结构。假单胞菌属为有机化能异养菌,代谢为呼吸而非发酵,有些是兼性化能自养菌,能利用H2或CO2为能源。分子氧是普遍的电子受体,有些能脱氮而利用硝酸盐为替代的受体。除能利用脱氮作用以厌氧呼

16、吸的一些外,均为严格或专性需氧菌。菌苔虽不明显呈色,但部分菌可产生水溶性色素和荧光色素。2 生长培养特性椰毒假单胞菌的某些菌株在有硝酸盐环境中可呈厌氧生长。营养要求不严格,几乎所有菌群在铵盐和单一碳源环境中均可生长。生长温度为2537 ,最适生长温度为37 ,最适产毒温度为26 。PDA平板上生长,菌落大小为12mm,呈乳白色或灰白色,光滑、湿润、边缘整齐;培养48h后,中心有突起,呈草帽状或放射状花纹;菌落周围有黄绿色素产生,并扩散到基质中。在365nm紫外灯下有黄绿色荧光。卵黄琼脂平板上生长,菌落表面光滑、湿润,48h后,菌落周围形成乳白色浑浊环,斜射日光下可见环的表面呈虹彩现象。S.S琼

17、脂平板不生长。以脱脂椰肉为基质,接种椰毒假单胞菌,30下培养4d产生的米酵菌酸,可溶于石油醚中,用PHS的水萃取后调pH至23,可再用石油醚或乙醚萃取,如此反复可得到较纯净的米酵菌酸。3 生化特性假单胞菌氧化糖类只产生少量的酸。蛋白胨糖水不适用于测定酸的产生。因为产生的酸常被蛋白胨分解产生的碱所中和。用铵盐培养基易测定酸的产生。因在该培养基中糖是唯一碳源。过氧化氢酶阳性。假单胞菌能产生和分泌许多胞外酶,包括蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶等。明胶酶的产生对其分类很重要。4 抵抗力在PDA上生长的椰酵假单胞菌,对金霉素、土霉素、四环素、庆大霉素较为敏感,对青霉素、红霉素、合霉素、氯霉素、新霉素具有很强的抗性。椰酵假单胞菌对一般常用的消毒剂都很敏感,但鉴于许多消毒剂本身的毒性和残留问题,仅可用于实验室消毒。亚硫酸氢钠对椰酵假单胞菌具有较强的抑菌和杀菌作用,可用于某些食品加工过程的消毒。5 抗原构造椰酵假单胞菌具有O、K、H3种抗原。很少发生交叉反应。O抗原为菌体抗原,耐热,凝集反应出现较慢,聚集物呈颗粒状。H抗原为鞭毛抗原,不耐热,凝集反应发生迅速