感染性病原真菌检验技术

1、感染性病原真菌检验技术1、组织胞浆菌属本属为典型的双相型真菌，37呈酵母样细胞，25培养形成菌丝体。重要的致病菌有荚膜组织胞浆菌及假皮疽组织胞浆菌，分别致犬、猫肉芽肿及马的淋巴管炎。荚膜组织胞浆菌引起人兽共患病是致犬、猫和人常发的高度接触性传染性组织胞浆菌病。严重者，可损伤全身器官。 淋巴瘤、白血病、霍奇金病、AIDS或用肾上腺皮质激素治疗者常可感染本菌。主要侵犯网状内皮系统，寄生在网状内皮细胞的胞浆内，使感染组织形成肉芽肿。奶牛、马、羊、猪及啮齿类动物也可自然感染，小鼠易感染。微生物特性在巨噬细胞和网状细胞内寄生时呈细小的、包有荚膜的圆球样细胞，直径l3m。在陈旧的病灶内，菌体较大，胞浆浓缩

2、于菌体中央，与细胞壁之间出现一条空白带。 2225培养时，在培养基上缓慢形成丝状菌落，开始为白色，逐渐变为棕黄色。菌丝分支分隔，宽2.5m。产生椭圆形光滑或多刺小分生孢子，直径2.53m，随后可产生圆形或椭圆形大分生孢子，称棘状厚壁大孢子，直径815m，表面光滑、均匀间隔的，像手指一样凸起，是本菌的特征性形态.在高湿、高浓度的二氧化碳中37培养时，在营养丰富的血培养基上，可形成湿润、有光泽、表面有皱褶的细小酵母样菌落；在肉汤中呈絮团状生长，镜检可见分支分隔的菌丝和少量孢子。镜检如发现特征性的棘厚壁大孢子，可做出诊断。活体病变组织末梢血及骨髓触片或涂片瑞氏染色，在单核细胞或多形核细胞中如有小的、

3、呈洋葱切面样卵圆形孢子，亦可做出诊断。病料接种小鼠可引起发病死亡，并可检出本菌。补体结合反应一般在发病后23周呈阳性反应。皮内变态反应试验可用于犬感染的流行病学调查。亦可采用PCR和核酸探针技术鉴定,微生物检验(1)标本直接显微镜检查痰液标本涂片后先用甲醇固定10 min，再用姬姆萨染色镜检，如巨噬细胞发现卵圆形孢子，直径24m的较小，一端有出芽，可疑为荚膜组织胞浆菌。(2)抗原检测取患者痰液作免疫荧光法染色后镜检，可快速检测其抗原，但特异性差，仅作组织胞浆菌初筛试验。(3)分离培养两相型将临床标本接种于含抗生素的沙氏培养基上，25培养，生长缓慢，46周才开始生长，逐渐形成白色至棕色绒毛状菌落

4、。当转种于血琼脂培养基上，37 很快形成酵母型菌落。(4)鉴定生化反应取可疑菌落涂片染色镜检，并作脲酶试验和明胶液化试验。荚膜组织胞浆菌分解尿素；不能液化明胶。(5)药物敏感试验 组织胞浆菌对两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑敏感。(6)抗体检测检测血清中组织胞浆菌抗体，以补体结合试验的敏感性和特异性最高，发病2-3周阳性率可达90，有判定价值。补体结合试验的抗体效价在：32以上为阳性，抗体效价4倍增长，可有助于确诊。乳胶凝集试验时，抗体效价为1：32时可确诊。 假皮疽组织胞浆菌马属动物流行性淋巴管炎的病原，特征为皮下淋巴管和淋巴结发炎、肿胀和皮肤溃疡。在自然情况下，马、骡最易感，驴次之；人、犬、骆

5、驼、牛、猪很少感染；家兔、豚鼠人工感染可引起局部脓肿。微生物特性在脓汁中该菌呈卵圆形或瓜子形，是具有双层膜的酵母样细胞。大小为23m35m，一端或两端较尖，多单在或23个排列，菌体胞浆均匀，可见24个圆形、呈回旋运动的小颗粒。在培养物中呈菌丝状，分支分隔、粗细不匀，菌丝末端形成瓶状假分生孢子。本菌为需氧菌，最适生长温度2530，最适生长pH59，常用培养基有1%葡萄糖甘露醇甘油琼脂、2%葡萄糖甘油琼脂等。不发酵多种糖类，不产生靛基质和H2S，VP试验阴性，能凝固石蕊牛乳，液化明胶。取脓汁或分泌物，适当稀释、镜检，或取痂皮，加10%KOH处理透明后，制片镜检。必要时可进行分离培养，病料应先用青、

6、链霉素处理12h后再接种。长出典型菌落时，用生理盐水制成悬液，接种家兔或豚鼠，观察有否脓肿，作为诊断参考。可根据是否产生变态反应做出诊断。方法是用该菌的培养物颈部皮内注射，4872h后测定皮肤增厚及肿胀性质，如注射局部发生硬固的热痛肿胀，皮肤增厚超过5mm即为阳性。此法特异性强，检出率高达80%以上。应用经高压后酒精或乙醚提取的抗原进行沉淀反应、补体结合反应检查马血清中的抗体，也是有效的诊断方法。2、念珠菌属该菌属半知菌纲的酵母菌念珠菌属有150多个种，仅白色念珠菌是常见的病原，致人和动物的念珠菌病。白色念珠菌存在于人和动物消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜，是机会致病菌，患念珠菌病的动物多在消

7、化道黏膜形成乳白色伪膜斑坏死物，主要侵害家禽，特别是雏鸡。牛、猪、犬和啮齿动物也可能感染。白色念珠菌致病性条件致病皮肤粘膜感染 鹅口疮，阴道炎内脏感染：肺炎、关节炎、膀胱炎，肾盂肾炎中枢神经感染：脑膜（脑）炎、脑脓肿过敏微生物特性假丝酵母菌呈圆形或卵圆形，直径3-6m。革兰阳性，着色不均匀。出芽方式繁殖。在组织内可见芽生孢子、假菌丝；在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。微生物检验(1)直接显微镜检查：取脓汁、痰和局部炎症性分泌物直接涂片，革兰染色后镜检，显微镜见到革兰阳性(着色不均匀)、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，可确认为假丝酵母菌感染。(2)抗原检测：取病人血清作ELISA、免疫印迹

8、法等检测白色念珠菌抗原。(3)核酸检测：用PCR法将白色念珠菌DNA分子扩增后以分子探针检测，具有较好的敏感性和特异性。 (4)分离培养 将标本接种在沙氏培养基上，25或37培养1d后，可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。(5)鉴定:1)芽管形成试验：将假丝酵母菌接种于0.20.5m|血清中，37孵育1.5h观察有无芽管形成。白色念珠菌可形成芽管，其他假丝酵母菌不形成芽管。2)厚膜孢子形成试验：将假丝酵母菌接种于玉米粉培养基25孵育1-2d后，白色念珠菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。 3)糖同化或发酵试验凡发酵某种糖一定能同化该糖，故只需做那些不发酵糖的同化试验。将假丝酵

9、母菌接种糖发酵管，25孵育，一般观察23d，对不发酵或弱发酵管可延长至10d或2-4周。观察有无酵母生长或液体培养基是否变混浊。现在商品化的产色培养基可快速鉴定白色念珠菌和其他假丝酵母菌。(6)药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC等药物敏感，但对5-FC极易产生耐药性。(7)抗体检测：早期诊断可用ELlSA夹心法、免疫酶斑点试验，方法简便。也可用乳胶凝集试验和对流免疫电泳试验等检测血清中抗白色念珠菌抗体。(8)动物试验：将假丝酵母菌悬液注射1ml于家兔耳静脉或注射0.2ml于小白鼠尾静脉，假丝酵母菌对动物无致病性。3、隐球菌属包括17个种和7个变种，广泛分布于自然界，人体体表、口腔和肠道中。外

10、源性感染, 经呼吸道侵入，由肺经血行播散,可侵犯肺、脑及脑膜、皮肤、骨和关节。好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者。现已发现新生隐球菌、浅白隐球菌和罗伦隐球菌有致病性。新型隐球菌引起的人兽共患病新型隐球菌在自然界广泛存在，可从土壤、空气、水果、牛乳，以及人的皮肤、肠道中分离到。易感新型隐球酵母病的动物有犬、猫，猪、马、牛和禽类，特别是鸽子，可作为其自然寄主和主要传染体。其主要传染途径是：孢子随尘埃被人吸入后停留于肺部，继而血行播散；通过体表外伤侵入人体；食用被污染，特别是被鸽粪污染的食品，发生肠道感染，继而血行播散。进入人体的病菌可到达很多部

11、位并发病，其中以中枢神经系统症状为最常见，如脑膜炎，其次有肺炎、肾炎、败血症以及皮肤、骨骼等症状。 微生物特性在组织中呈圆形或卵圆形，直径一般在46m，外周有宽厚荚膜，荚膜较菌大13倍，折光性强，一般染色法不易着色而难以发现而得名。常采用墨汁负染色法，在黑色景下可镜检到透亮菌体和宽厚荚膜。非致病性隐球菌无荚膜。微生物检验(1) 标本直接镜检：用病人脑脊液作墨汁负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简便、快速方法。常规细胞染色可发现隐球菌，但易误诊和漏诊。如用PAS染色后新生隐球菌呈红色。(2) 抗原检测用乳胶凝集试验、ELISA、和单克隆抗体法等免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖特异性抗原，已成为临床上的常

12、规诊断方法。其中以乳胶凝集试验最为常用，此法简便、快速。特别对直接镜检和分离鉴定阴性者更有诊断价值。ELISA敏感性和特异性都较高。单克隆抗体法除有较高敏感性和特异性外，标本无须稀释和预先处理的优点。(3) 核酸检测可用痰液、支气管吸出物等标本核酸检测方法有DNA探针法、PCR探针法等，用于检测的探针、引物主要选自保守区的重复序列。可检出新生隐球菌，并可区别类型，是新生变种还是格特变种。非致病性隐球菌不被检出。此方法不受药物治疗的影响，还能正确评价临床疗效和愈后等。 (4) 分离培养将标本接种在沙氏培养基上，病原性隐球菌在25和37生长，而非病原性隐球菌在37时不生长。培养25d后观察菌落形态

13、特点，并取菌落作印度墨汁负染色镜检。() 鉴定1）酚氧化酶试验：接种L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经25d培养，呈棕黑色菌落。2）脲酶试验：能产生脲酶分解尿素琼脂培养 基中的尿素形成NH4+和CO2，使pH升高，培养基可由黄色变粉红色，而白假丝酵 母菌为阴性。3）糖同化及发酵试验：能同化葡萄糖、 半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能发酵多糖 类，不能同化硝酸盐。非致病性隐球菌不能同化肌醇。丝囊霉菌微生物特性外形与真正的真菌相似，由纤细的分支的丝状菌丝组成。但细胞壁由纤维素构成，而大多数真菌的细胞壁成分是几丁质。丝囊霉菌还有管状的线粒体嵴，也有别于真正的真菌。菌丝的一系列片段均可发育成孢子囊。孢子囊的

14、形成和发射孢子的适宜温度为1624，但完成从初级孢子到次级游走孢子形成过程的适宜温度是24。次级游走孢子运动缀慢而不协调。不同基因型的螯虾丝囊霉菌在生活过程中均会产生高水平的几丁酶，有一定鉴别意义。微生物检验通过病原分离和形态学鉴别迸行诊断。无菌切取感染组织12mm2的小片置分离培养基表面，室温下培养，将出现的菌丝转移到新鲜的琼脂平板上，直到平板无其他污染菌为止。鉴定丝囊霉菌属必需诱导并观察孢子形成。取带有生长活力菌丝的一小块琼脂（直径34cm），置于GPY肉汤中20孵育4d，用灭菌的池塘水洗5次，然后于其中20过夜。大约12h后形成原代孢囊群落，在显微镜下可见出现能游动的次级游走孢子。再结合

15、典型的丝囊霉菌无性繁殖特征可鉴定到种。近年来发展的PCR、原位杂交等技术可检测种特异性rRNA基因，简便快捷，适用于大规模样品的检测。5、肺孢菌属肺孢菌是一种机会病原微生物，可感染马、牛、羊、猪、犬、猫、鼠等多种动物，有宿主特异性。在正常健康的宿主体内通常不表现明显的临床症状，而在免疫功能低下的动物体内可引起严重的肺炎。特征为明显的呼吸道症状，普遍性或局灶性肺炎，肺泡内充满孢子。卡氏肺孢菌为感染动物的肺孢菌曾称为卡氏肺孢子虫。分类还存在一些争议。已往大多数学者依据抗原虫药有效和具有孢囊、滋养体两种形态，认为应属于原虫。近来分子生物学研究发现，卡氏肺孢子虫线粒体的16s和5s核糖体RNA的核苷酸

16、序列与真菌有更多的同源性，染色特性也类似真菌，应归属于真菌。卡氏肺孢菌广泛分布于自然界，主要是空气传播，在健康人体内，多为无症状的隐性感染。当宿主免疫力下降，潜伏的卡氏肺孢菌在病人肺内大量繁殖扩散，使肺泡上皮细胞受损，导致间质性浆细胞肺炎，又称卡氏肺孢菌性肺炎, 是AIDS最常见、最严重的机会感染性疾病，病死率高达70100。微生物特性生活史有包囊和滋养体两种形态。滋养体壁较薄，单个核，形态不规则，直径25m，姬氏染色后胞质呈蓝色，核呈紫红色。包囊为感染型，滋养体为繁殖型，呈二分裂法繁殖。包囊分为成熟包囊和未成熟包囊，前者壁较厚，直径68m，呈球形，内含8个囊内小体，大小11.5m，呈球形排列规则或不规则单个核；后者一般呈椭圆形，35