红细胞的保存操作规程

1、红细胞的保存红细胞输注是临床输血的最主要内容，因此，红细胞的保存是血液保存的最重要研究课题。红细胞的保存，主要是利用各种技术和保存液，设法延长红细胞的有效保存时间，包括添加剂红细胞的液态保存和红细胞冰冻保存等。一、红细胞的液态保存（一）浓缩红细胞1ACD或CPD保存液采集的全血当日分离出血浆，剩下的红细胞为浓缩红细胞，血细胞比容0.70，可在(42)保存21天。2用ACDA或CPDA保存液采集的全血，分出血浆后的浓缩红细胞，血细胞比容0.75，可在(42) 保存35天。3用CPDA-2保存液（比CPDA-1多l倍腺嘌呤和0.4倍葡萄糖）采集的全血，分出血浆后的浓缩红细胞，血细胞比容为0.80左

2、右，在(42)可以保存3542天。CPDA-2是较理想的浓缩红细胞保存液。全血除去大部分血浆后，不仅使维持红细胞能量代谢的添加剂如腺嘌呤和葡萄糖部分随血浆被移出，并且使剩下的浓缩红细胞变得非常黏稠。给患者输注时，流速变慢，输注不容易，医务人员不易按受。而且由于分浆后浓缩红细胞中蛋白质减少，贮存中也易发生溶血，因此很少使用。目前基本上被添加剂红细胞所取代。（二）悬浮红细胞（添加剂红细胞）为改善红细胞的保存，在全血分离去除大部分血浆后的浓缩红细胞中加入无蛋白质的红细胞保存液主要是各种含有葡萄糖的晶体盐溶液悬浮红细胞，一方面使浓缩红细胞适当稀释，便于输注，同时因含有红细胞营养成分和红细胞膜稳定成分，

3、利于红细胞的有效保存。1晶体盐悬浮红细胞 (1)浓缩红细胞加生理盐水，只能保存24小时。 (2)浓缩红细胞加NaCl、腺嘌呤、葡萄糖(SAG)溶液保存悬浮红细胞，在(42)保存35天后，红细胞存活率为82.6%。它是采用塑料三联袋或四联袋系统采血，主袋含有CPD保存液，另一袋含有SAG保存液及一个空袋。全血分出血浆和血小板后，把SAG保存液移到含有浓缩红细胞的主袋中，完全密闭操作以防止细菌污染。2SAGM保存液悬浮红细胞 为防止高比积浓缩红细胞制备的红细胞悬液溶血增加，在SAG保存液中加入甘露醇作抗溶血剂（红细胞膜稳定剂），即形成了氯化钠-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(SAGM)保存液。这种悬浮红细

4、胞在(42)保存35天后，体内存活率为83.4%，溶血率下降0.4%。3SAGS保存液悬浮红细胞 氯化钠-腺嘌呤-葡萄糖-蔗糖(SAGS)保存液由中国医学科学院输血研究所建立。用蔗糖代替甘露醇，保存效果与SAGM基本一致，但溶血率低于SAGM保存液。4MAP保存液悬浮红细胞 在SAGM保存液中保存的红细胞如果抗凝不理想时，长期保存可有纤维蛋白生成，为防止产生这种现象，在SAGM保存液中加入少量磷酸盐，即形成MAP保存液。5SAGM-麦芽糖保存液悬浮红细胞 利用五联袋系统采血，主袋为CPD保存液，第1子袋为空袋，第2、3、4子袋装有SAGM-麦芽糖溶液。采血后把血浆分到第1子袋，把第2子袋的溶液

5、加入到主袋中，悬浮红细胞置于4保存4周后离心，再把上清液移人第2子袋，然后将第3子袋的保存液再注入主袋，置37保温1小时后，在4保存4周，同样操作能保存12周。6红细胞复苏液 在红细胞保存末期，红细胞2，3-DPG和ATP会有明显下降，目前已研究出一种多功能复苏液，即将含有丙酮酸盐、肌苷、葡萄糖、磷酸盐、腺嘌呤及NaCl的溶液加入到保存末期的浓缩红细胞中，在37保温1小时，可达到红细胞复苏的目的。复苏后的红细胞ATP和2，3-DPG恢复到正常水平，有正常携氧和放氧能力，并改善输血后存活率。复苏后的红细胞用前要去除复苏液，24小时内输用或甘油化冰冻保存。（三）悬浮红细胞的优点1在浓缩红细胞中加入

6、了各种晶体盐溶液，红细胞流动性好、输注方便。2因去除了全血中的太部分血浆，仅有少量的血浆残留在红细胞悬液中，可以预防血浆引起的大多数不良反应；同时，在紧急情况下可以较为安全地为ABO血型相容而不相同的患者输注。3晶体盐保存液可为红细胞提供足够的葡萄糖、腺嘌呤等营养物质，同时具有红细胞膜稳定剂，可延长红细胞有效保存期。4充分地利用血液资源，一血多用。因此，悬浮红细胞是目前应用最多的一种红细胞制剂。（四）去白细胞悬浮红细胞质量控制项目和要求1、外观：肉眼观察应无色泽异常、溶血、凝块、气泡等情况；血袋完好，并保留注满全血经热合的导管至少35cm。2、容量：标示量（ML）10%3、血红蛋白含量（g）

7、来源于200ml全血：含量18g来源于300ml全血：含量27g来源于400ml全血：含量36g4、血细胞比容：0.45-0.605、白细胞残留量 来源于200ml全血：残余白细胞 2.5106个 来源于300ml全血：残余白细胞 3.8106个来源于400ml全血：残余白细胞 5.0106个 6、储存期末溶血率 红细胞总量的0.87、无菌试验 无细菌生长二、红细胞的冷冻保存血液的冷冻保存研究开始于20世纪40年代。1949年Polge和Smith等人发现甘油对牛精子的冷冻保存有保护作用，从中得到启示。第2年，Smith应用甘油作保护剂冷冻红细胞获得成功。其后，血液冷冻保存的研究迅速发展，但是

8、由于没能解决去除防冻保护剂的问题，临床未能得到广泛应用。1956年，Tullis应用Cohn分离器去除保存红细胞中的防冻剂甘油，从而使冷冻红细胞成功地应用于临床。但因方法比较复杂，仍未得到广泛推广。1963年，Huggins发现红细胞在糖溶液中有可逆性的聚集反应，利用此反应原理，可用糖液洗涤法去除防冻保护剂甘油。从此以后，冷冻红细胞逐渐在临床上得到广泛应用。在以后的研究中，对去除防冻剂的方法又有进一步改进，Meryman筹人利用不同浓度梯度的氯化钠洗涤红细胞去除防冻剂，经过不断改进，现在在工艺方法上已日益完善，开创了保存血液的另一重要途径。当前发达国家，已将冷冻血作为一种特殊血液制剂常规供应临

9、床。冷冻血液保存研究的成功，是血液保存方法上的重大突破，为解决血液长期贮存、保障供血和对稀有血型患者输血以及自身输血创造了条件。（一）红细胞的低温损伤机制红细胞的低温损伤机制是冷冻保存血细胞的重要问题之一，解决这一问题不仅有利于细胞保存，而且还有助于杀伤人类有害细胞。许多学者对此进行研究，提出各种学说。1盐变性学说 Lovelock等人提出，水结冰时使细胞内外所产生的高浓度电解质作用于细胞膜，引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失，增加了细胞对阳离子的通透性，并使细胞膜上形成一些小孔，冰融化时水进入细胞内引起渗透休克，这是慢速冷冻细胞损伤的主要原因。2冰晶的机械作用 在快速冷冻时，细胞内形成

10、许多冰晶，冰晶作用于细胞膜，使细胞膜上产生小孔，使得细胞膜不可逆地丧失其半透性，这是快速冷冻时细胞损伤的主要原因。3化学损伤 Levitt提出：冷冻时，在细胞脱水和溶质浓缩过程中，蛋白质组分异常靠近，最终使蛋白质分子中巯基(SH)和二硫键(SS)发生相互不可逆的反应，导致蛋白质变性而引起细胞死亡。4细胞的融化反应 生物细胞的融化反应比冷冻反应更为复杂，有些冷冻保存细胞融化以后，完全丧失了渗透反应，有些细胞则表现为一定范围的正常的渗透反应，然后就恢复正常，也有一部分溶解，这是细胞的正常反应。还有一些细胞显示出异常高的渗透反应。对于最好的融化程序，目前尚有争议，但从一些最佳复原生物材料实践来看，慢

11、速冷冻的标本应慢速融化，而快速冷冻的标本则应采用快速融化的方法。（二）红细胞冷冻保护剂红细胞由液态转变为固态，会因前述的各种机制发生损害，因此，红细胞需加入冷冻保护剂，才可进行有效的冷冻保存。保护剂的特征：小分子保护剂能自由地通透细胞膜，具有高溶解度及对细胞的低毒性，它们能与水形成氢键，从而有很高的溶解热。加入保护剂后，可降低溶液的冰点，并增加未冻水量，如果被溶的盐数量一定，未冻水中盐的浓度降低，使细胞处于盐浓度较低的环境中。有效的保护剂及合适的浓度与最佳升降温速率相结合，可以对红细胞进行成功的保存。大分子保护剂的保护作用与小分子类似（除了不能穿透细胞外），能使溶液的冰点降低，增加不冻水量。另

12、外大分子还可能影响冰的形成。（三）冷冻保护剂的种类冷冻保护剂可根据它们能否穿透细胞膜分为两种，即细胞内保护剂和细胞外保护剂。细胞内保护剂有甘油、DMSO、葡萄糖、乙二醇、甲醇、乙醇、乙酰胺、甲酰胺等。细胞外保护剂有乳糖、麦芽糖、木糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、右旋糖酐、白蛋白、羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、甘露醇等。（四）红细胞低温保存与玻璃化玻璃化就是生物材料在由液态向固态转化过程中没有相变热产生，也就是没有晶体生成，实际上这很难达到。有人认为冷却速率达到1x l04s，颗粒直径小于5lOnm就不致使生物材料受到泠冻损伤，这就叫玻璃化。玻璃化是保存生物材料最有效的方法，要想最终解

13、决组织和器官的低温保存，必然通过玻璃化这条途径。要想提高生物材料的冻存成活率，也必须研究生物材料的玻璃化问题。添加冷冻保护剂或快速冷冻生物材料的目的就是使生物材料中的水处于容易达到玻璃化状态。（五）红细胞冷冻保存过程与洗涤应用红细胞的冷冻保存首先需要将红细胞甘油化，以有效保护红细胞进入冰冻状态，然后将甘油化的红细胞置于低温（-65-196）长期保存，保存期可长达10年。然后，在需要应用时将冰冻保存的红细胞适当加温融化，通过各种方法洗涤去甘油，再用一定量的生理盐水悬浮红细胞，供患者输注。当前在临床上应用的冷冻红细胞制备方法基本上有两种：慢速冷冻法，即使用高浓度甘油处理红细胞，最终使甘油在红细胞中

14、的浓度大约为40%( W/V)，冷冻条件可以在无需严格控制冷却速率的情况下进行，冷冻和贮存使用-65以下机械冰箱即可，解冻需慢速融化。去除甘油试剂可用糖液聚集法或不同浓度梯度NaCl洗涤法。快速冷冻法，即使用低浓度甘油处理红细胞，使红细胞中最终甘油浓度大约为18%( W/V)，然后将甘油化的红细胞置于液氮中（-196）迅速冷冻，再将冷冻后的红细胞放在液氮蒸气中（-156）贮存。解冻时需快速融化。去甘油方法可用不同浓度梯度NaCl，由高渗逐渐过渡到等渗分次洗涤。1慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法 此方法由美国人哈金斯( Huggins)发明，1963年应用于临床。(1)制备流程（国内改进）ACD或CP

15、D全血(200ml) 离心移出血浆浓缩红细胞(90120ml) 加等体积甘油化试剂甘油化红细胞（室温平衡半小时） 置-80冰箱或干冰中贮存冷冻红细胞 3740水浴中融化解冻红细胞 加等体积的50%葡萄糖溶液后，分别再用10蔗糖溶液500ml洗脱3次，分别去除上清去甘油红细胞 加lOOml 0.9%NaCl悬浮后，离心去上清再加lOOml 0.9%NaCl重新悬浮悬浮红细胞 测上清血红蛋白和残留甘油浓度合格后临床输用 (2)甘油化：分离血浆后所得的浓缩红细胞转移到专用洗涤塑料袋中，袋内装有一由塑料管密封的电磁搅拌器。在电磁搅拌器的搅拌下缓缓加入等体积的甘油试剂。甘油化试剂配方：甘油 ( g/v)

16、 79.2%葡萄糖 ( g/v) 8.0%果糖 (g/v) 1.0%EDTA 2Na 0.3% (3)洗涤去甘油：国外均采用5%果糖进行洗脱甘油，因果糖价格昂贵，我国用蔗糖代替果糖比较经济。糖液聚集洗涤法去甘油原理：在pH 5.26.1的范围内，血浆中的丙种球蛋白与红细胞膜的脂蛋白之间可形成一种可逆性的复合物，当加入非电解质溶液（如果糖、葡萄糖、蔗糖等）时，由于离子强度减小，离子间引力也减小，与脂蛋白结合的球蛋白之间又可结合，使红细胞聚集成团块沉积下来，除去含甘油的上清液；当加入电解质如生理盐水，可使球蛋白之间的结合断开，或升高pH也可使丙种球蛋白与红细胞膜脂蛋白之间的结合断开，使红细胞重新悬

17、浮。2慢速冷冻盐液洗涤制备法 由美国人Meryman首先建立。使用不同浓度梯度的NaCl溶液先由高渗逐渐过渡到等渗，可用大容量离心机反复离心或用连续流动式离心机分离、洗脱去除冷冻红细胞的防冻剂，达到去甘油的目的。此方法比糖液洗涤法经济，红细胞回收率高，并且质量好，现在为大多数国家所采用。我国目前多采用大容量离心机分次离心洗涤，同样可达到质量要求。 (1)制备流程ACD或CPD全血(200ml) 离心移出血浆浓缩红细胞(90120ml) 加入160ml 57.1%甘油化试剂甘油化红细胞 室温平衡半小时，置-80冰箱或干冰中贮存冷冻红细胞 3740水浴中解冻解冻红细胞 加入40ml 9%NaCl，

18、再加0.9%NaCl 250ml离心去上清，再加0.9% NaCl 400500ml离心去上清，再用0.9%NaCl洗涤一次去甘油红细胞 加lOOml 0.9% NaCl悬浮红细胞 测上清血红蛋白和残留甘油浓度合格后临床输用 (2)甘油试剂配方甘油 (g/v) 57.1%乳酸钠 (M) 0.14氯化钾 (mM) 5磷酸氢二钠 (mM) 53快速冷冻红细胞制备方法 由美国纽约血液中心Rowe首先建立。 (1)制备流程ACD或CPD全血离心移出血浆浓缩红细胞加入等体积甘油化试剂甘油化红细胞 -196液氮中冰冻保存冷冻红细胞 45水浴中3分钟内完全融化解冻红细胞 利用细胞分离器或标准离心机分次洗涤，

19、加16%甘露醇 生理盐水300350ml离心去上清一次洗涤红细胞 加0.9%NaCl或0.2%葡萄糖的生理盐水10002000ml离心去上清去甘油红细胞 加等体积的0.9% NaCl或含有0.2%葡萄糖的生理盐水悬浮悬浮红细胞 测上清血红蛋白和残留甘油浓度合格后临床输用 (2)甘油试剂配方甘油 ( w/v) 28%甘露醇 ( w/v) 3%氯化钠 ( w/v) 0.65%（六）冰冻解冻去甘油红细胞质量控制项目和要求由于制备技术不断改进，质量标准在不断提高。全国全血及成分血的质量要求规定，冰冻解冻去甘油红细胞质量标准如下：1外观：肉眼观察应无色泽异常、溶血、凝块、气泡等情况；血袋完好，袋上应保留至少20cm长分段热合注满冰冻解冻去甘油红细胞的导管。2血容量： 来源于200ml全血 ：200ml20ml来源于300ml全血 ：300ml30ml 来源于400ml全血 ：400ml40ml3血红蛋白含量： 来源于200ml全血 ：含量16g来源于300ml全血 ：含量24g来源于400ml全血 ：含量32g4白细胞残留量： 来源于200ml全血 ：含量2107/袋来源于300ml全血 ：含量3107/袋来源于400ml全血 ：含量4107/袋5甘油残留量：10g/L 6无菌试验：无细菌生长。（七）冷冻红细胞的特点和临床应用1优点 冷冻红细胞保存期可长