免疫组织化学技术共29张课件

1、免疫组织化学技术41、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，而是针对疯狂的法律。马克吐温42、法律的力量应当跟随着公民，就像影子跟随着身体一样。贝卡利亚43、法律和制度必须跟上人类思想进步。杰弗逊44、人类受制于法律，法律受制于情理。托富勒45、法律的制定是为了保证每一个人自由发挥自己的才能，而不是为了束缚他的才能。罗伯斯庇尔免疫组织化学技术免疫组织化学技术41、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，而是针对疯狂的法律。马克吐温42、法律的力量应当跟随着公民，就像影子跟随着身体一样。贝卡利亚43、法律和制度必须跟上人类思想进步。杰弗逊44、人类受制于法律，法律受制于情理。托富勒45、法律的制定

2、是为了保证每一个人自由发挥自己的才能，而不是为了束缚他的才能。罗伯斯庇尔 免疫组化技术1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（技术）。2、基本原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下

3、可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 刚踏进初中门槛的小朋友，对初中的一切充满了好奇和向往。第一堂课，第一堂数学课，应该给学生一个什么样的印象?这是每个初一数学教师要思考的问题。上得好，会给学生留下难以忘怀的印象；上砸了，可能会给学生在三年的学习中，带来难以弥补的损失。结合自己的经验，我认为这堂课要解决如下几个问题：一是激发学生的兴趣，引发他们对初中数学的向往；二是要让学生了解初中数学研究的内容；三是让学生明白数学这门功课的特点，需要用到的一些基本方法。本课教学的基本方法是讲演式，但一定要设计几个有趣的、难度不大的问题和活动，

4、让学生参与进来。 教学活动安排1?笨?场白：同学们，你们学了6年数学了，觉到数学是什么样子?初一学生的特点必是踊跃说出自己的看法，大部分感到数学就是算算画画，也有小朋友说学数学可以使人更聪明，也有同学说数学有很广泛的应用该老师总结了：数学是换脑的一门学科。学数学的目的是什么？就是换脑。说得通俗一点，当你考虑不严谨的时候，通过数学的训练变得严谨了；当你计算不准确的时候，通过数学变得准确了；当你反应不灵活的时候，通过数学的刺激变得灵活了，于是你这个学生整体素质就得到提高了，整体素质提高了，你将来干什么都能行，数学是特点就是在这儿。学生明白了数学原来这么有用啊！那就好好学吧。下一个问题就提出来了。

5、教学活动安排2提出问题“学好数学就要多做题，做题的目的是什么？”孩子们又是叽叽喳喳，这时我强调一个观点，你做的这道题，考试不考的可能性是百分之百，为什么要做？另一道题考试不考的可能性也是百分之百，为什么还要做呢？就是通过做这个题训练一种速度，提炼一种方法，形成一种技能。这个题目的思想和方法，因为你做这个题，就在你头脑中得到沉淀。将来再遇到类似的题目，类似的现象，一刺激你的大脑，大脑的沉淀被激活，于是当年的情景就会回想起来，解法和答案就呈现在你的眼前。做题的意义就在这里。那初中就接着做题吧，但初中的数学和小学数学是有区别的。 教学活动安排3“初中数学与小学数学的学习有什么区别？” 很多学生在小学

6、时数学成绩很好，但上了初中之后会渐渐被其他的同学超过，并且，越往高年级表现越明显。这其中的原因并不是一个简单的没有好好学的问题。其实，主要是因为很多学生在上初中之后没有很好地使用初中数学的学习方法和思维习惯。要学好中学数学，就应该了解它与小学数学的区别。小学数学的学习以考察运算能力为主；初中数学主要是考察对各个知识环节进行理解、分析、思考、判断能力，这样并不是运算能力强就会得高分。下面结合具体事例看初中数学与小学数学学习区别与联系。 例1小学的应用题大多都可以用算术法来解题，所谓“算术法”就是指一个全部由数字和符号构成的式子，因为计算简便，成了小学六年来学生们解题的“主菜”，即使小学里学习了方

7、程，但也只能算是“配菜”而已。可进入初中后就不同了：自从初一上学期详细的学习了一元一次方程后，渐渐的，凡是应用题第一反应就是设未知数列方程，而对原先的“算术法”没什么印象了。这是因为，用算术法来解应用题大多要用逆向思维，而方程所用的大多是正向思维，两者孰轻孰重一目了然。下题就是个很好的例子： 鸡兔同笼：今有雉兔同笼，上有三十五头，下有九十四足，问雉兔各几何？ 翻译成现代语言大意是：笼子里面有一些鸡和一些兔子，共有35个头，94只脚，问鸡和兔各有多少只？ 这个问题如果放在小学的话用算术法是比较简单的： （只）为兔数， （只）为鸡数。 而用初中的一元一次方程就看似有些麻烦了： 设鸡有 只，兔有 只

8、，列出方程： 解得：（只） 在二元一次方程中就更复杂了： 设鸡有 只，兔有 只，列出方程组： 解之得： 这样看来，用方程解题似乎比算术法更“麻烦”一些，但认真分析就会发现，用方程解题的话，方程简单易懂，不会在理解上出问题，比如用二元一次方程就是完全顺着题目所给条件来解，这样方程一目了然，解题中也避免了不必要的错误。一元一次方程也是如此。相对来说，式子简单的算术法却因不易理解，有时即使计算对了仍是一头雾水。而且这道题用算术法作比较“简单”完全是因为题目的“便利”，鸡有2只脚，兔有4只脚，笼中也只有两种动物，所以比较简单。如果另选一道相同类型但条件中所给数字不同的题，情况就逆转了： 以绳测井，若将

9、绳三折测之，绳多五尺；若将绳四折测之，绳多一尺。绳长、井深各几何？ 翻译成现代汉语大意是：用绳子测量水井的深度，如果将绳子折成三等分，一份绳长比井深5尺；如果将绳子折成四等分，一份绳长比井深1尺。绳长、井深各是几尺？ 这道题再用算术法和方程解，哪个更“简单”，就留给大家自己今后探索了。 例2你能从一张长方形的纸上剪下一个最大的正方形吗？让学生动手操作，学生大都是会的，那你能说明为什么吗？有些茫然了，这就是初中数学不但要知道是什么，还要知道为什么。紧接着提下一个问题“将两个同样大小的正方形分拼成一个正方形吗？”，学生又开始思考操作，发现自己有了方法，欣喜若狂，原来初中数学就在折折剪剪中的出答案。

10、难度加大，那么，你会不会将三个同样大小的正方形分拼成一个大正方形呢? 留给大家课后探索。这样，当天的作业也有了。 由以上几点就可以看出，初中数学与小学数学的不同之处主要体现在知识范围与思维方式两个方面，要学好初中数学，一定要让自己的思维更富逻辑性，要学会用数学的眼光去发现问题，分析问题和解决问题。如此以来，初中数学的学习并不是一件难事。或许你会发现：原来初中数学世界是如此奇妙！ 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文课堂教学是教师、学生、教材三者的有机结合。其中学生是学习的主体，教师是课堂的主导，教材是师生要共同探讨和学习的对象。所以我认为在数学课上教师要想尽办法调动

11、学生上数学课的积极性，不断提高学生分析问题和解决问题的能力。结合我多年的教学经验，从下面几个方面谈谈我在课堂教学上的一些做法和点滴体会。 一、注重课堂教学的引入环节 引入是课堂教学的重要环节，能做到恰当、合理、积极、有效的引入，在整个课堂教学过程中起着非常重要的作用，我在数学课堂中常用的引入方法有以下几种。 （一）故事导入，激发学习兴趣和学习欲望 数学是理科性的知识，是一门要求非常严谨的学科，许多学生学习起来感觉枯燥乏味，时间一长也容易产生倦怠感。所以，我想如果能把数学课也上得很生动，势必会带动学生学习数学的积极性，给自己的课堂增加一些吸引力和活力。于是我在课堂的导入上有时会增加一些小故事。例

12、如，在讲有理数的乘方时，我引入了这样一个小故事：有一天巴衣老爷对阿凡提说：“你能每天给我10元钱，一共给我20年吗？”阿凡提说：“尊敬的巴衣老爷，如果你能第一天给我1毛钱，第二天给我2毛钱，第三天给我4毛钱，以此类推，一共给我20天，那我就答应您的要求。”巴衣老爷眼珠子一转说：那好吧！亲爱的同学们，你们知道巴衣老爷和阿凡提谁得到的钱多吗？这样一个小故事，随即就把学生带入到我要讲的新课当中去，许多同学认为阿凡提上了巴衣老爷的当，吃了大亏。急着要去算一算，这样学生心中对乘方就有了一个大概的了解，再进入新课学习阶段就显得顺理成章。 （二）活动引入 在素质教育紧迫要求的今天，既要提高学生的知识水平，又

13、要提高学生的社会实践能力，提高学生的全面素质。课堂上如何体现素质教育的精神，是我们课堂教学目标之一。 例如，在教学一元一次方程解有关利润、利润率这一类应用题时，我们可以利用游戏引入课题：今天我们来做一个游戏，希望同学们认真观察。游戏名称：卖衣服。要求：一个人演制衣厂批发商，批发衣服给个体户，只能把出厂价告诉个体户（假设每件衣服40元）。一个人演个体户，从制衣厂批发衣服一件（假设），并设法卖给顾客，只能赚钱不能赔，不让顾客知道进价，另一个人演顾客买衣服，以自己的满意价格买走衣服，可以与个体户讨价还价，必须买走衣服（假设60元买走）。（三个学生做游戏，其他学生观察，同时记下衣服的进货价和售价。）通

14、过做游戏，学生兴致勃勃，很快投入课堂学习中。 数学课堂教学的引入方法是千变万化的，还有设疑引入、审题解题引入等不同的方法，教师要根据不同的课型采用不同的引入方法，唤起学生的注意，诱发学生的学习动机、兴趣和积极性。只要在教学的实践中善于总结，善于提高，必定可以把课堂搞活，为提高课堂的教学效果铺路搭桥。 二、注重教学过程中教与学过程的统一 在数学教学中，教师要扮演好自己的角色，充分发挥自身的引导作用，让学生主动参与、乐于探索，调动学生的学习潜能，使学生能以饱满的情绪投入到新知识的学习中。 （一）还主动权给学生，一石激起千层浪 我们一直说学生是课堂的主体，教师是课堂的主导，教师的角色有时候更像是个导

15、演一样，要设法才能让学生学得更起劲。所谓“会者不难”，真正检验学生是否学会了教材中的知识，我认为不用等到单元或阶段性的测试，每堂课都是考验学生的主战场。所以我采用了抛砖引玉的教学策略，每当我将概念原理的推导过程讲解清楚以后，我就会让学生和我进行角色互换，人人都可以成为“小老师”。我会鼓励学生登上讲台，去展示他自己的思考过程。当学生走上讲台的一刹那，我知道他克服了心理的恐惧和紧张，无疑我们又在另一个层面锻炼了学生，学生会越来越自信。另外注意一题多解的训练，例如，讲完因式分解后做练习，已知：a+b=3，ab=5，求代数式a2-3ab+b2的值。当学生写出正确的解题过程后，我会问还有其他解法吗？学生

16、就会重新考虑寻求新思路，最终你说一种他说一种，有的从已知出发向所求算式转换，有的会从要求的算式向已知靠拢讲出多种思路，真是有“一石激起千层浪”的感觉，这个时候我就会跟学生说：你们看“条条大路通罗马！”学生也为自己出色的表现而自信倍增，同时也懂得了知识就是要学以致用、活学活用。 （二）巧用顺口溜，变复杂为简单 在数学解题中，书上的解题方法说得清清楚楚，详详细细，很好理解，却很难记住，所以我就想有没有更简单的方式让学生能清晰的记住这些好方法。于是，我在备课时搜罗了一些顺口溜，这些顺口溜朗朗上口，合辙押韵，非常容易记住。例如，在讲不等式组的解集时会出现好几种情况，如何让学生快速准确地掌握求解集的方法

17、，我采用了这样一个顺口溜：都大取大，都小取小，一大一小中?g找，比大的大比小的小就无处找。这句顺口溜简单明了地把不等式组解集的四种情况说得明明白白，学生也相当欢迎这样的方法。再如，有理数加法运算法则：同号相加一边倒，异号相加大减小，符号跟着大的跑，绝对值相等零正好。这些顺口溜方便了学生的记忆和计算。 总之，数学教学要紧密联系学生的生活实际，从学生已有的知识和经验出发，创设民主、和谐的教学氛围，引导学生通过观察、操作、归纳等活动，掌握基本的数学知识和技能，激发学生学习数学的兴趣，增强他们学好数学的自信心，发展他们的数学能力。 免疫组织化学技术41、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，免疫组织化

18、学技术共29张课件免疫组织化学技术共29张课件免疫组织化学技术共29张课件免疫组织化学技术共29张课件4、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。4、被检测的物质5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同 1）Westernblotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Westernblotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或

19、核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Westernblo免疫酶标法下的两个实验流程简介 一、SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水。 2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修

20、复方法。自然冷却，再用3分钟3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37孵育23小时或4过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟5次。 7）滴加生物素标记的二抗，室温或37孵育30min-1h。8）PBS冲洗，3分钟5次。9）滴加SP（链霉亲和素过氧化物酶），室温或37孵育30min1h。 10）PBS冲洗，3分钟5次。 11）显色剂显色（DAB等）。12）自来水充分冲洗。13）可进行复染，脱水，透明， 14）选择适当的封片剂封片。 免疫酶标法下的两个实验流程简介 二、二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次

21、，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟二、二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色310分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度DAB-二氨基联苯胺是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性

22、产物。用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好。是HRP结合物最常用的底物常在免疫组化,原位杂交,Westernblot等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶中应用广泛。 苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，它在被氧化后生成苏木精，同媒染剂（常用的是三价的铁或铝的盐）一起使用，能够使细胞核染色。苏木素是一种碱性染料。甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜D2、免疫荧光方法中的重要环节 1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液

23、进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切

24、记要避光反应。2、免疫荧光方法中的重要环节 6）封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。7）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的pH和离子强度的使用附和要求。6）封片：

25、为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作切片的制作组织的固定组织石蜡包埋切片切片的制作组织的固定目的: （1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。 （2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4）固定剂兼有

26、硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。组织材料的固定目的:组织材料的固定固定液的选择：(1)甲醛固定液：10福尔马林，10中性福尔马林，10中 性缓冲福尔马林(2)4多聚甲醛固定液(3)Bouin S液及改良Bouin S液(4)Zenker S液(5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂 较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25m

27、l。(8)Kanovsky S液(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂固定液的选择：固定时间： 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。固定时间：大组织：75乙醇30120min，85乙醇30120min，95醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇过夜，无水乙醇30 60min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30m

28、in石蜡12h，石蜡23h。小组织：75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h、1h、过夜或2h，无水乙醇、和各30min，二甲苯15min、10min、10min（肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡12h。组织石蜡包埋大组织：75乙醇30120min，85乙醇30120切 片载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液浸泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。（2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片丙酮5min 用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮） 13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml切 片载玻片的清洁：切片： 石蜡切片： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4保存数年 冰冻切片： (1)冰冻切