高同型半胱氨酸致动脉粥样硬化机制与干预研究讲义

1、高同型半胱氨酸致动脉粥样硬化机制与干预研究讲义研究背景MDGs: chronic diseases are not on the agenda. The Lancet, 2005;1512 -14.动脉粥样硬化性疾病是全球死亡的首要病因300万研究背景高同型半胱氨酸血症是导致AS的重要独立危险因素同型半胱氨酸（Hcy）5umol/L冠心病风险男性 60%女性 80%总胆固醇20mg/dl Clark R, et al, N Engl J med. 1991; 324:1149-1155.Boushey CJ, et al. JAMA. 1995; 274:1049-57.研究背景问题1： 国人

2、高同型半胱氨酸血症与冠心病发病存在何种联系？如何有效降低高同型半胱氨酸血症所带来的冠心病发病风险？研究背景MMPs参与动脉粥样硬化的发生发展MMPs/TIMPs失衡内皮功能受损平滑肌细胞增殖、迁移炎症因子、氧化损伤MMPMMPMMP研究背景问题2： MMPs（尤其是MMP-2、-9）如何参与动脉粥样硬化的形成？其作用是否受高同型半胱氨酸等影响，如何有效抑制MMPs的异常改变？研究背景适量饮用红葡萄酒有助于改善动脉粥样硬化研究背景黄酒也具有心血管保护作用 抗氧化 降低总胆固醇 免疫炎症因子调节但与红葡萄酒的心血管保护作用的研究相比，相关研究还远远落后研究背景问题3： 黄酒是否也具有与红酒类似的抗

3、动脉粥样硬化作用？其对心血管系统的具体保护作用及机制又如何？总体思路与研究目的致病因素发病机制预防干预同型半胱氨酸MMP-2黄酒探索高同型半胱氨酸血症与冠心病发病、冠心病危险因素的关系，及叶酸的干预价值探索同型半胱氨酸经MMP-2参与动脉粥样硬化发病的机制探索适量黄酒对动脉粥样硬化的干预作用和机制动脉粥样硬化研究周期2001年2013年历时12年整研究对象1、临床研究对象：2001年6月至2003年6月之间在本院住院行冠状动脉造影的患者（126例）2、基础研究对象： C57BL/6遗传背景的雄性LDL受体基因敲除小鼠（LDLR-/-小鼠）； SD大鼠胸腹主动脉来源的血管平滑肌细胞（VSMC）；

4、 SD大鼠胸腹主动脉来源的血管内皮细胞（EC）。（一）致病因素冠心病（58）亚冠心病（37）正常（31）单支病变(27)冠脉造影患者(126)双支病变(20)三支病变(11)高危组(37)低危组(31)对照组(10)高HcyHcy正常补充叶酸8周Hcy叶酸研究结果（一）冠心病、亚冠心病组Hcy高于对照组，而叶酸、VitB12低于对照组，且冠心病组的变化较亚冠心病组更明显。 研究结果（一）Hcy与冠脉病变程度、危险因素呈正相关。叶酸、Vit B12与上述因素呈负相关。 研究结果（一）叶酸补充治疗后，冠心病、亚冠心病患者Hcy及叶酸水平显著改善。研究小结（一）1、冠心病、亚冠心病患者血浆同型半胱氨

5、酸水平明显升高，是冠心病的危险因素之一。2、同型半胱氨酸水平与冠脉病变程度、冠心病危险因素呈正相关。3、叶酸干预可降低同型半胱氨酸水平，可作为冠心病高危人群的预防用药。（二）发病机制LDLR-/-小鼠VSMC标饲组蛋氨酸组高脂+蛋氨酸Hcy经MMP-2参与AS发病的机制研究脂+蛋+肝素脂+蛋+他汀血清TC、TG、ox-LDL、Hcy等主动脉粥样斑块面积描记斑块内MMP-2分布（免疫组化）斑块内MMP-2表达与活性12周HcyHcy+他汀Hcy+肝素Hcy+叶酸Hcy+Mg2+Western Blot 检测MMP-2蛋白表达MTT 检测VSMC迁移活动Hcy+红霉素Zymography 检测MM

6、P-2活性研究结果（二）-动物实验瑞舒伐他汀、肝素可有效降低血脂水平，但对Hcy水平的干预作用无统计学差异。 研究结果（二）-动物实验瑞舒伐他汀、肝素可显著抑制动脉粥样斑块的形成，且他汀的抑制较肝素更明显。 研究结果（二）-动物实验MMP-2免疫组化证实，瑞舒伐他汀、肝素可显著抑制粥样斑块内MMP-2表达，且他汀的作用较肝素更明显。研究结果（二）-动物实验粥样斑块内MMP-2的活性同样被显著抑制。 研究结果（二）-细胞实验Hcy可呈浓度相关地促进MMP-2表达与活化。 研究结果（二）-细胞实验瑞舒伐他汀、肝素可呈浓度相关地抑制Hcy诱导下MMP-2的表达与活化。 研究结果（二）-细胞实验Hcy

7、可呈浓度相关地促进VSMC迁移（3-8），而瑞舒伐他汀可有效抑制这一活动（9-14）。 研究结果（二）-细胞实验叶酸、Mg2+、红霉素等可呈浓度相关地抑制Hcy诱导下MMP-2的表达和活化。叶酸 Mg2+ 红霉素研究结果（二）-细胞实验叶酸、Mg2+、红霉素等可呈时间相关地抑制Hcy诱导下MMP-2的表达和活化。叶酸 Mg2+ 红霉素研究小结（二）1、LDLR-/-小鼠动脉粥样斑块内的MMP-2出现过度表达和活化，而参与了动脉粥样斑块的发展。2、在Hcy等刺激下，VSMC过度表达和活化MMP-2，并出现过度迁移，而瑞舒伐他汀、肝素、叶酸、镁离子、红霉素的干预可减弱MMP-2的表达和活化，且瑞舒

8、伐他汀能抑制VSMC的迁移。综上：Hcy刺激下，MMP-2出现过度表达和活化，进而促进细胞外基质降解和细胞迁移，是Hcy经MMP-2参与动脉粥样硬化发病的重要机制之一, 而瑞舒伐他汀、肝素、叶酸、镁离子、红霉素的干预可明显改善上述情况。（三）预防干预LDLR-/-小鼠EC对照组黄酒组红酒组适量黄酒抑制动脉粥样硬化的作用及机制研究酒精组血清TC、TG、HDL-C、Hcy主动脉粥样斑块面积描记MMP-2、-9、TIMP-2（免疫组化）MMP-2、-9表达、活性Western Blot 检测MMP-2蛋白表达RT-PCR 检测MMP-2 mRNA表达Zymography 检测MMP-2活性12周对照

9、组黄酒组红酒组酒精组VSMCWestern Blot 检测MMP-2蛋白表达Zymography 检测MMP-2活性对照组黄酒组Hcy组研究结果（三）-动物实验黄酒可以显著降低小鼠血浆Hcy水平。研究结果（三）-动物实验黄酒、红酒的干预均可明显抑制小鼠主动脉粥样斑块的形成。研究结果（三）-动物实验1）黄酒能显著减小粥样斑块的面积，且效果与红酒相似（图3.2 a-d）；2）MMP-2表达主要位于粥样斑块纤维帽下和溃疡处，动脉内皮处也有少量表达，而黄酒、红酒显著减少了MMP-2表达（图3.2 e-i）；3）MMP-9表达量弱于MMP-2，黄酒、红酒的干预减少MMP-9表达（图3.2 j-m）；4）

10、各组间TIMP-2表达与分布无显著差异（图3.2 n-q）。研究结果（三）-动物实验黄酒、红酒可显著抑制动脉内MMP-2、MMP-9的表达，且MMP-9的总体表达弱于MMP-2，而TIMP-2无明显改变。 注：C：Control；E：Ethanol；R：Red wine；Y：Yellow wine。 研究结果（三）-动物实验黄酒、红酒可显著抑制动脉组织内MMP-2、MMP-9的活性。 act-MMP-2 act-MMP-9 研究结果（三）-细胞实验（VSMC）黄酒能显著减少Hcy诱导下VSMC对MMP-2的表达和活化，但三种浓度间无显著差异。不同黄酒干预浓度研究结果（三）-细胞实验（VSMC）

11、黄酒能呈时间相关地减少Hcy诱导下VSMC对MMP-2的表达和活化。不同黄酒干预时间 研究结果（三）-细胞实验（EC）Hcy可呈浓度及时间相关地促进EC对MMP-2蛋白表达。浓度梯度 时间梯度 研究结果（三）-细胞实验（EC）RT-PCR进一步证实，Hcy可呈浓度及时间相关地促进EC对MMP-2 mRNA的表达。浓度梯度 时间梯度 研究结果（三）-细胞实验（EC）Hcy可呈浓度及时间相关地促进EC对MMP-2的活化。浓度梯度 时间梯度 研究结果（三）-细胞实验（EC）黄酒、红酒可显著抑制Hcy诱导下EC对MMP-2蛋白和mRNA的表达。WB检测MMP-2蛋白RT-PCR检测MMP-2 mRNA

12、研究结果（三）-细胞实验（EC）Zymography 检测MMP-2活性黄酒、红酒可显著抑制Hcy诱导下MMP-2的活性。研究小结（三）1、适量黄酒能显著抑制高脂喂养下LDLR-/-小鼠粥样斑块的形成与发展，且这一效应可能是通过降低血浆Hcy浓度并抑制斑块内MMP-2/-9的表达和激活而实现的；2、适量黄酒可以抑制Hcy诱导下VSMC、EC对MMP-2的表达和激活。综上：适量黄酒可以通过降低血浆Hcy以及减少Hcy诱导下VSMC、EC对MMP-2的表达和激活，进而减少动脉管壁内MMP-2的分布和活性，最终实现对动脉粥样硬化病变的有效抑制。研究结论 高同型半胱氨酸血症是国人冠心病发病的重要危险因

13、素，与冠脉病变程度及冠心病危险因素成正相关，而叶酸的干预可降低血浆同型半胱氨酸水平，有助于减少动脉粥样硬化的发生。 高同型半胱氨酸等危险因素刺激下，MMP-2出现过度表达和激活，进而促进细胞外基质降解和细胞迁移、增殖，是同型半胱氨酸经MMP-2参与动脉粥样硬化发病的重要机制。 瑞舒伐他汀、适量黄酒及肝素、叶酸、红霉素、镁离子等干预可通过抑制MMP-2而发挥抗动脉粥样硬化的作用。 讨论致病因素发病机制预防干预同型半胱氨酸VSMC瑞舒伐他汀黄酒叶酸肝素Mg2+动脉粥样硬化MMP-2ECLDLR-/-小鼠研究创新点1、国内早期开展高同型半胱氨酸血症与冠心病发病、冠心病病变程度及冠心病高危因素之间的关

14、系研究。2、国内早期开展叶酸干预降低同型半胱氨酸血症的研究。3、开展同型半胱氨酸经MMP参与冠心病发病的机制研究。4、开展黄酒预防冠心病的作用及机制研究。5、开展瑞舒伐他汀、肝素、叶酸、红霉素、镁离子等预防冠心病的机制研究。研究成果共计发表论文34篇SCI 14篇专著4部培养研究生8名发表论文及著作 Yafei SHI, Jufang CHI, Weiliang TANG, Fukang XU, Long-bin LIU, Zheng JI, Hai-tao LV, Hang-yuan GUO*. Effects of rosuvastatin on the production and ac

15、tivation of matrix metalloproteinase-2 and migration of cultured rat vascular smooth muscle cells induced by homocysteine. J Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol). 2013; 14(8):696-704. Guo H, Lv H, Tang W, et al. Rosuvastatin may modulate insulin signaling and inhibit atherogenesis beyond its pl

16、asma cholesterol-lowering effect in insulin-resistant mice. Cardiovasc Drugs Ther. 2012; 26(5):375-82. Guo H, Liu L, Shi Y, et al. Chinese yellow wine and red wine inhibit matrix metalloproteinase-2 and improve atherosclerotic plaque in LDL receptor knockout mice. Cardiovasc Ther. 2010; 28(3):161-8.

17、 Hangyuan Guo, Yafei Shi, Longbin Liu, Aijing Sun, Fukang Xu, Jufang Chi. Rosuvastatin Inhibits MMP-2 Expression and Limits the Progression of Atherosclerosis in LDLR-deficient Mice. Arch Med Res. 2009; 40(5):345-51. Hangyuan Guo, Fukang Xu, Aijing Sun, Longbin Liu, Yafei Shi. Heparin Inhibits the P

18、roduction of Matrix Metalloproteinase-2 and Improves Atherosclerosis in LDL receptor-deficient Mice. Coron Artery Dis .2009; 11:24. Guo H, Lee JD, Uzui H, Yue H, Wang P, Toyoda K, Geshi T, Ueda T. Effects of heparin on the production of homocysteine-induced extracellular matrix metalloproteinase-2 i

19、n cultured rat vascular smooth muscle cells. Can J Cardiol. 2007; 23(4):275-80.发表论文及著作 Guo H, Wang P, You B, Xing Y, Lee JD. Chinese yellow wine inhibits production of homocysteine-induced extracellular matrix metalloproteinase-2 in cultured rat vascular smooth muscle cells.Clin Nutr. 2007; 26(3):34

20、8-54. Guo H, Lee JD, Uzui H, Yue H, Wang J, Toyoda K, Geshi T, Ueda T. Effects of folic acid and magnesium on the production of homocysteine-induced extracellular matrix metalloproteinase-2 in cultured rat vascular smooth muscle cells. Circ J. 2006; 70(1):141-6. Guo H, Lee JD, Yue H, Uzui H, Xing Y,

21、 Wang J, Toyoda K, Geshi T, Ueda T. Effect of erythromycin on homocysteine-induced extracellular matrix metalloproteinase-2 production in cultured rat vascular smooth muscle cells.Indian J Med Res. 2005; 121(6):764-70. Guo H, Lee JD, Uzui H, Toyoda K, Geshi T, Yue H, Ueda T. Effects of copper and zi

22、nc on the production of homocysteine-induced extracellular matrix metalloproteinase-2 in cultured rat vascular smooth muscle cells.Acta Cardiol. 2005; 60(4):353-9. Guo H, Lee JD, Ueda T, Cheng J, Shan J, Wang J. Hyperhomocysteinaemia & folic acid supplementation in patients with high risk of coronar

23、y artery disease. Indian J Med Res. 2004; 119(1):33-7. Guo H, Lee JD, Xing Y, Cheng J, Ueda T, Toyoda K, Geshi T. Changes of homocysteine levels and arterial endothelial function in patients with high risk of coronary artery disease after 6-month folic acid supplementation.Acta Cardiol. 2004; 59(5):

24、503-6. Guo H, Lee JD, Ueda T, Shan J, Wang J. Plasma homocysteine levels in patients with early coronary artery stenosis and high risk factors.Jpn Heart J. 2003; 44(6):865-71.发表论文及著作 J. Chi, H. Uzui1, H. Guo, T. Ueda and J.D. Lee. Effects of eplerenone on the activation of matrix metalloprotainase-2

25、 stimulated by high glucose and interleukin-1 in human cardiac fibroblasts. Genet Mol Res.2013 (In press) Fang-fang YANG， Hang-yuan GUO*，Ju-fang CHI，et al. Yellow Wine and Red Wine: the Primary Prevention in Coronary Artery Disease. South China Journal of Cardiology. 2009; 10(1)：40-42. 季政，郭航远*，池菊芳，等

26、. 黄酒对同型半胱氨酸诱导的大鼠血管内皮细胞基质金属蛋白酶2表达的影响.2013,29(2):341-347. 季政，郭航远*，池菊芳，等. 同型半胱氨酸对大鼠血管内皮细胞MMP-2表达的影响和黄酒、红葡萄酒的逆转效应及机制J.西安交通大学学报（医学版）, 2013,34(3):316-322. 吕海涛，郭航远*，池菊芳，等.瑞舒伐他汀对胰岛素抵抗所致动脉粥样硬化LDLR-/-小鼠 AKT、P-AKT表达的影响.同济大学学报医学版，2012，33(1) ：37-42,58. 邢杨波，郭航远*，史亚飞，等.瑞舒伐他汀对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶2表达和细胞迁移的影响.中华老年医学杂志，2011

27、， 30(7)：593-597. 刘龙斌，郭航远*，许富康，等.瑞舒伐他汀对LDL受体基因缺陷小鼠MMP-2表达和粥样斑 块形成的抑制作用.浙江医学，2011，33(7)：1020-1023,1110. 王平，郭航远*，邢杨波，等.肝素对大鼠血管平滑肌细胞同型半胱氨酸诱导的基质金属蛋 白酶-2表达的影响.心电学杂志，2011，30(1)：17-19,67. 邢杨波，郭航远*，史亚飞，等.同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞MMP-2表达、细胞迁 移的影响及瑞舒伐他汀的逆转作用.浙江医学，2011，33(7)：1004-1007.发表论文及著作 许富康，郭航远*.适量饮酒抗冠状动脉粥样硬化性心脏病的

28、可能机制研究进展.中国全科医学，2011，(27)：3076-3078. 刘龙斌，郭航远*，史亚非，等.黄酒和红葡萄酒抑制LDLR-/-小鼠MMP-2表达和动脉粥样硬化斑块形成.中国病理生理杂志，2010，26(4)：676-680. 许富康，郭航远*，孙爱静，等.肝素对LDL受体基因敲除小鼠基质金属蛋白酶-2表达的抑制及抗动脉粥样硬化作用.浙江医学，2010，(11)：1597-1600. 刘龙斌, 郭航远*, 池菊芳. 基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化中的研究进展. 中国全科医学，2009 12(7A):1232-1234. 邢杨波，郭航远*，王平，等.黄酒对同型半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞基质分泌金