实验四血清球蛋白的提纯详解演示文稿

1、实验四血清球蛋白的提纯详解演示文稿第一页，共二十一页。（优选）实验四血清球蛋白的提纯第二页，共二十一页。请同学们清洗自己小组以下用品每个小组：层析柱（1支）比色板（2块）玻璃棒（1支）离心管 （1支）滴管 （2支）烧杯 （2个）试管 （13支）注意实验过程中每用一次清洗一次！第三页，共二十一页。问题1.血清蛋白质的分类？ 清蛋白、1球蛋白、 2球蛋白、 球蛋白、 球蛋白2.分离纯化蛋白质的方法？ 电泳、透析及超滤、有机溶剂沉淀、盐析、免疫沉淀、层析、超速离心法等3.盐析？层析？透析？ 加入中性盐破坏蛋白质稳定因素而使其沉淀（水化膜和电荷层） 利用各组分理化性质不同而分离（本实验是利用组分分子大

2、小不同而分离） 半透膜把大小分子分开4.本实验盐析所用硫酸铵饱和度是多少？ 33%5.定性检测蛋白质和铵根离子的方法？ 缩二脲反应（紫红色） 或者 与磺柳酸反应生成白色沉淀 纳氏试剂（黄色或棕色）第四页，共二十一页。一.实验目的 1.掌握蛋白质分离纯化方法； 2.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质 的基本原理； 3.熟悉离心机的操作； 4.熟悉蛋白质、NH4+定性检测的方法。第五页，共二十一页。分离纯化蛋白质的方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析离心膜分离技术透析超滤第六页，共二十一页。二.实验原理 本实验是应用相同浓度的

3、硫酸铵反复盐析分离血清中的-球蛋白，再利用凝胶层析法除盐，即可得到比较纯的-球蛋白。 采用盐析法分离清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物质。第七页，共二十一页。二.实验原理（一）盐析（salting-out）定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使其从溶液中沉淀析出的现象。 原理: 破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。优点：蛋白质不变性，常用方法。第八页，共二十一页。二.实验原理（二）透析（dialysis）定义：利用半透膜把大小分子分开。 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达

4、到分离的方法。 其利用半透膜原理，通过扩散、对流体内各种有害以及多余的代谢废物和过多的电解质移出体外，达到净化血液的目的，并且达到纠正水电解质及酸碱平衡的目的。临床应用：血液透析 第九页，共二十一页。二.实验原理（三）层析（chromatography） 层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。 按层析的原理不同可以分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。（教程P25） 凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的物质（分子大小不同） 小分子进入凝胶颗粒的微

5、孔中，流程长，下移速度慢；大分子不能进入凝胶颗粒的微孔中去，只能分布在颗粒的间隙中，所以流程短，向下移动速度快。第十页，共二十一页。二.实验原理凝胶层析法（根据分子大小差异而分离）第十一页，共二十一页。二.实验原理（四）离心（centrifuge） 离心技术是利用离心力，依据物质的沉降系数、扩散系数和浮力密度差异而进行物质的分离、浓缩和分析的一种技术。第十二页，共二十一页。二.实验原理离心操作要领1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。2、检查离心管套筒是否完好、套筒内有没有软胶

6、垫或棉花。3、精确地平衡离心管及其内容物（配平）。4、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置。5、启动离心时离心速度由慢到快。第十三页，共二十一页。二.实验原理（五）检测蛋白质、 NH4+的方法检测蛋白质 缩二脲试剂：溶液显紫红色 20磺柳酸 ：有白色沉淀产生检测NH4+ 纳氏试剂：黄色或棕色第十四页，共二十一页。三.实验操作 1、盐 析 2、透 析 3、层 析（脱盐） 4、检 测第十五页，共二十一页。1、盐析取离心管一支加入血清2ml加入2ml PBS，摇匀逐滴加入pH7.2饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀上清液（主要含清蛋白）倾入试管中静置10分钟，再离心（2000转/分）10分

7、钟沉淀用1ml PBS搅拌溶解逐滴加饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀倾弃上清液（主要含、球蛋白）沉淀即为初步纯化的球蛋白透 析脱 盐静置10分钟，再离心（2000转/分）10分钟用于配平用于配平样品为猪血清第十六页，共二十一页。2、透析清蛋白 换 水透析袋刚放入水中时,立即取袋外液体检查有无NH4；每隔4分钟检查一次，共3次，比较NH4透出的情况。 约0.5小时，检查袋外液体的NH4情况；取袋外液2滴，置于小试管中，然后滴加20磺柳酸12滴，观察有无沉淀产生。水 水 第十七页，共二十一页。3、层析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上样球蛋白，PBS 10滴溶解 装柱 装柱前用滤

8、纸片堵住层析柱下口，防止下端玻纱堵塞葡聚糖凝胶G25，柱 高3/42/3柱长流速：每分钟10滴左右 加入洗脱剂PBS 10ml 收集20滴换一支试管第十八页，共二十一页。 层析后洗脱液检测每组两块比色板,洗净备用。一块在各孔滴加纳氏试剂（检测NH4+）,另一块滴加缩二脲试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。检测蛋白及铵根离子不用滴管,避免污染,直接用试管倾倒。用“-”表示无现象，用“+”, “+”, “+”等表示颜色深浅。 回收凝胶第十九页，共二十一页。四.实验结果(用+ -号表示，不写颜色)表1. 层析后洗脱液的显色结果表2. 透析后的袋外溶液显色结果试管编号12345678910缩二脲试剂检测后现象纳氏试剂检测后现象检测次数123456试 剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂20%磺柳酸现 象检测人： 时间：检测人： 时间：第二十页，共二十一页。五.注意事项.正确使用离心机。.装柱时