蛋白质浓度测定方法比较

1、1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。2、700l bufferA，65，10m，中间混匀一次3、苯酚350l，氯仿(l fn)350l，混匀3m，12000rpm，5m4、上清500l 至1.5ml epp，500l等体积氯仿，混匀3m，12000rpm，10m5、上清400l到1.5ml epp，异丙醇400l0.7-1，12000rpm，2m，掏出DNA，毛细管6、沉淀用70%乙醇洗2次，每次3m7、自然凉干10m，30lTE，充分溶解8、琼脂糖凝胶电泳鉴定第一页，共十五页。蛋白质浓度(nngd)测定方法比较 第二页，共十五页。一、 实验(shyn)目的学习(xux)三种蛋白质浓度的

2、测定方法，并比较优缺点。 第三页，共十五页。二、 实验(shyn)原理与步骤OH 磷钼酸、磷钨酸Pr+CuSO4 Pr-Cu络合物紫红色蓝色化合物蛋白质测定的范围：25250g/mL标准蛋白(dnbi)BSA 250g/mL测定波长：660nm1、 Lowry法Foling-酚法反响(fnyng)原理：第四页，共十五页。 测定步骤(bzhu)：标准蛋白BSA 250g/mL 1依次向试管中参加试剂：2A660Pr作图，求待测蛋白(dnbi)浓度管号123456待测1待测1，BSA(mL)00.20.40.60.81.01.01.0D.W(mL)1.00.80.60.40.2000Pr(g/mL

3、)试剂甲（mL）5.0 室温反应10分钟（双缩脲反应）试剂乙（mL）0.5 立即振摇，30水浴20分钟A660第五页，共十五页。原理：蛋白质分子中Tyr, Try, Phe的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有UV吸收(xshu)的性质，吸收(xshu)顶峰在280nm处。测定范围：0.11mg/mLpr测定波长：280nm标准蛋白BSA： 1mg/mL测定步骤：1向各试管中依次参加各种试剂：2以A280nm-Pr作标准曲线，求待测蛋白(dnbi)浓度管号123456待测1待测1，BSA（mL）00.51.02.03.04.04.04.0D.W(mL)4.03.53.02.01.0000Pr(mg

4、/mL)A280nm2、紫外线UV吸收(xshu)法：第六页，共十五页。3、考马斯亮蓝显色(xin s)法Bradford法 实验原理：PrCBBG-250-Pr复合物 A595 标准蛋白(dnbi)BSA： 250g/mL 操作步骤：1依次向各试管中参加各种试剂：2以A595nm-Pr作标准曲线，求待测蛋白(dnbi)浓度管号123456待测1待测1，BSA（mL）00.20.40.60.81.01.01.0D.W(mL)1.00.80.60.40.2000Pr(g/mL)CBBG-250（mL）5.0A595nm第七页，共十五页。 蔗糖(zhtng)酶km值的测定 第八页，共十五页。一、实

5、验目的：掌握sucrose酶的km测定的实验方法。二、实验原理： 蔗糖酶是一种水解酶，催化反响：蔗糖+水G+F 每水解1molS，生成2mol复原(hun yun)糖，因此可用比色皿测定复原(hun yun)糖量，即可知底物的水解速度。复原(hun yun)糖可复原(hun yun)3，5-二硝基水杨酸DNS生成红棕色的氨基化合物，即3-氨基-5-硝基水杨酸。第九页，共十五页。三、实验(shyn)步骤 管号蔗糖（ml）H2O（ml）123456780.50.7511.522.5344.54.2543.532.521每管加酶液0.5 ml37准确作用(zuyng)5 minNaOH 0.5 ml

6、每管取0.5mlDNS 0.5ml沸水浴3min冷却DW 4mlA520取8只试管，按下表分别参加如下(rxi)试剂： 以1/A5201/S作图，求Km第十页，共十五页。四、Km测定的意义:1、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；2、代谢研究特别(tbi)是分支代谢途径的调节，Km代表E争夺S的能力，对反响速度代谢的计算非常重要。五、本卷须知：1、底物浓度应选择在Km值附近；2、反响时间应尽可能短，以保证反响初速度；3、酶活力不能太高，否那么不易控制；4、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。第十一页，共十五页。 DNS-aa的聚酰胺薄膜层析(cn x) 第十二页，共十五页。一、实

7、验原理：荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨DNS-Cl,能与氨基酸的N末端结合生成荧光物质(wzh)DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白质的游离氨基结合，生成DNA-Pr或DNS-肽，经酸水解后释放出DNS-aa，各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，DNS-aa在360或280nm紫外光下发黄色荧光。二、实验(shyn)步骤：1、取聚酰胺薄膜1张一人一张，铅笔做上样点标记2、上样，毛细管上样直径2mm，屡次上样3、展层通风橱内4、检测，用吹风机吹干，紫外光检测第十三页，共十五页。实验错开做，以防止仪器和试剂使用拥挤！DNA提取实验放在第一或第二个做分光光度计和水浴锅已调好，请不要(byo)调动波长和温度，比色皿专用，请勿混用。实验报告第十四页，共十五页。内容(nirng)总结1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。7、自然凉干10m，30lTE，充分溶解。标准蛋白BSA 250g/mL。测定步骤：标准蛋白