高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展课件

1、高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展天津市药品检验所 田勇 高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展天津市药品检验 1概述 1概述中药是灿烂的中华文明重要的组成部份，是前人在几千年的历史长河中，在认识自然，与疾病抗争的过程中摸索积累的经验，是智慧的结晶，是人类宝贵的知识财富和文化遗产。中药是灿烂的中华文明重要的组成部份，是前人在几千年的历史长河中药主要包括植物药、矿物药和动物药。 中药主要包括植物药、矿物药和动物药。 中药材种类繁多，不同品种的中药材之间，活性成份的含量往往相差悬殊，有时相差不止一个数量级；即使同一种药材，往往由于栽培、生长环境、采收季节等多种因素的影响，其有效成份

2、的数量和含量往往也相差很大。中药材种类繁多，不同品种的中药材之间，活性成份的含量往往相差中药的有效成份种类繁多而复杂，常用的植物药材中，主要包括: 有机酸类化合物 蒽醌类化合物 生物碱类化合物 黄酮类化合物 皂苷类化合物 萜类化合物 多糖类化合物等 中药的有效成份种类繁多而复杂，药物分析有两个主要任务：定性和定量。就中药材的鉴定而言，在实际工作中，我们经常选取药材中的一种或几种有效成份作为目标化合物，通过对目标化合物进行分离、检出，可以获得药材的真伪、产地等信息；通过对目标化合物进行定量，可以对药材的质量优劣做出判断；对中药制剂的质量控制而言，对其中的一种或几种有效成份进行分离、定量，可以有效

3、地控制药物的质量。药物分析有两个主要任务：定性和定量。高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis,HPCE)技术是近三十年来国际上迅速发展起来的一种的分离分析技术，具有高效、快速、样品体积小、溶剂消耗少、无污染等特点，不仅广泛应用于生物大分子如核酸、蛋白质等的分析，在中药分析方面也显示出其优势，下面对HPCE的原理及其在中药分析中的应用进行介绍。高效毛细管电泳(High Performance Capil2高效毛细管电泳简介2高效毛细管电泳简介2.1概念电泳(Electrophoresis) 带电粒子在外加电场中，受电场力驱动，被吸引或

4、被排斥而引起的差速运动。2.1概念2.2.历史2.2.1.自由电泳(Free electrophoresis) 1937年，Tiselius首先将电泳运用于蛋白质混合物的分离。将蛋白质混合物放入到缓冲溶夜中，并施加一个外加电场，发现样品组分以其电荷和淌度所决定的方向和速度发生迁移。2.2.历史以此为标志，电泳逐渐发展成为一门分离技术。在自由电泳方式下，由于受到对流和热扩散等因素的限制，分离效率很低。以此为标志，电泳逐渐发展成为一门分离技术。2.2.2.平板电泳(Plate electrophoresis) 利用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶等具有抗对流特性的介质，制成凝胶板，使电泳在平板上进行。2.2

5、.2.平板电泳(Plate electrophores高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展课件2.2.3.毛细管电泳(Capillary electrophoresis) 作为平板电泳的一种替代方式，使电泳在毛细管中进行。由于毛细管的内径很小，其自身具有抗对流特性，所以可以省略起此作用的凝胶介质。在毛细管中，不仅可以进行自由溶液电泳，而且可以进行凝胶电泳。2.2.3.毛细管电泳(Capillary electrop1967年，Hjertn首次对用毫米级孔径的毛细管进行的开管电泳的工作进行了报道。后来，Virtanen和以后的Mikkers分别用内径大约为200m的玻璃和聚四氟乙烯毛细管

6、进行了电泳分离。1967年，Hjertn首次对用毫米级孔径的毛细管进行的开高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展课件2.2.4.高效毛细管电泳(High performance capillary electrophoresis)高效毛细管电泳是从传统电泳发展进化而来。 1981年，Jorgenson和Lukacs首先在内径为75m的石英毛细管内，使用高电压对物质进行了电泳分离，并在其随后的工作中，使该技术得到了改善和提高。Jorgenson还阐明了有关的理论，解释了操作参数和分离质量之间的关系，揭示了高效毛细管电泳(HPCE)作为一种分析技术所具有的重要价值和巨大的潜力。 2.2.4.

7、高效毛细管电泳(High performance2.3.HPCE的基本原理及工作方式毛细管电泳是以高压电场(E，可达30 kV) 的电场力为驱动力，以小内径的石英毛细管(常用20-70 pm，有效长度50-75 cm) 为分离通道，依据各组分之间电泳迁移率(mobility)或分配系数的差异而实现分离的液相分离技术。2.3.HPCE的基本原理及工作方式2.3.1.电泳淌度 对于一个球形的带电离子， e=q/6r 其中，q:离子电量 r:离子半径 :溶液粘度2.3.1.电泳淌度电泳淌度是一个物理常数。电泳淌度的高低取决于离子的带电量、离子半径及溶液黏度。电泳淌度是一个物理常数。2.3.2.电渗流

8、(EOF) 电渗流(EOF)是HPCE操作中一个基本的组成部分。是毛细管内壁表面电荷所引起的毛细管内部液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。电渗流通过对溶质淌度叠加一个体相流速来控制溶质在毛细管内停留的时间。 2.3.2.电渗流(EOF)电渗流(EOF)的大小可用速度或淌度表示： VEOF=(/)E 或 EOF=/电渗流(EOF)的大小可用速度或淌度表示： 其中，VEOF:速度 EOF:电渗淌度 :zeta电位 :介电常数 其中，VEOF:速度HPCE的工作过程是这样的，一根内径很细的弹性石英毛细管，两端置于两个缓冲液瓶中，瓶内的溶液与管内的溶液是相同的。在毛细管的两端各有一个

9、电极。进样时，将其中一个缓冲液瓶换成样品瓶，对样品外加一个气压或电压，然后重新换回缓冲液瓶，在毛细管两端施加一个电场，分离便开始了。光学检测直接在毛细管的另一端的管壁上进行。 HPCE的工作过程是这样的，一根内径很细的弹性石英毛细管，两高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展课件2.4.HPCE的分类按其分离模式不同，可分为毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)、胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC)、毛细管凝胶电泳(Capillary Gel El

10、ectrophoresis,CGE)、毛细管等电电泳(Capillary isoelectric focusing,CIEF)、毛细管等速电泳(Capillary isotachophoresis.CITP)、毛细管电色谱(Capillary Electrochromatography， CEC ) 、非水毛细管电泳(Non Aqueous Capillary Electrophoresis，NACE)。2.4.HPCE的分类由于有多种分离模式可供选择，HPCE的应用范围很广。毛细管区带电泳(CZE)多用于带电物质的分离分析，如无机离子、有机酸、氨基酸、蛋白质、多肽、对映体等；由于有多种分离模

11、式可供选择，HPCE的应用范围很广。胶束电动毛细管色谱(MECC)是唯一的既能分离中性溶质又能分离带电组分的电泳技术，适合于氨基酸、核酸、肽类、药物（小分子物质）、手性药物及体液的分离；胶束电动毛细管色谱(MECC)是唯一的既能分离中性溶质又能分毛细管凝胶电泳(CGE)主要用于生物大分子的分离分析，如蛋白质、核酸、RNA、DNA，还可用于聚合酶链式反应(PCR)产物的分析； 毛细管凝胶电泳(CGE)主要用于生物大分子的分离分析，如蛋白毛细管等电电泳(CIEF)主要用于蛋白质等电点的测定、分离异构体等； 毛细管等电电泳(CIEF)主要用于蛋白质等电点的测定、分离异毛细管等速电泳(CITP)常用于

12、离子型物质的分离，如有机酸；毛细管等速电泳(CITP)常用于离子型物质的分离，如有机酸；2.4.1CZECZE也称为毛细管自由溶液区带电泳，是HPCE中最简单的一种方式，也是目前应用最广泛的一种方式。电泳分离是以电场中溶质的电泳迁移速度的差异为基础的，溶质因为在电场中不同的迁移方向和速度而被分离。溶质的迁移速度应当是电泳速度和电渗流速度的矢量和，可表示为:2.4.1CZEuap = uef + uos = （ef 十os）E或者ap =（ef 十os）式中，uap 表示为表观迁移速度；ap 称为表观迁移率；uef 和uos分别代表电泳速度和电渗流。 uap = uef + uos = （ef

13、十os）E当样品从正极端注入到毛细管内时，不同符号的离子将按不同的速度向负极迁移。分离出峰次序是:正离子中性分子负离子。中性分子总与电渗流速度相同，不存在迁移速度的差异，因而不能分离。 当样品从正极端注入到毛细管内时，不同符号的离子将按不同的速度高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用进展课件2.4.2MECC MECC是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合。它是在电泳缓冲液中加入表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)或十六烷基三甲基嗅化铰(CTAB) ，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，单个的表面活性剂分子之间发生聚集，其疏水性的一端向内聚在一起以避开缓

14、冲溶液，带电荷的一端向外朝向缓冲溶液，进而形成团状结构的胶束(假固定相)，2.4.2MECC其分离机理是基于胶束与溶质之间的相互作用。溶质不仅可以由于迁移率差异而分离，同时又可基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。在一般毛细管电泳中不能分离的中性化合物，在MECC中可以分离。MECC弥补了CZE不能分离中性物质的不足。其分离机理是基于胶束与溶质之间的相互作用。溶质不仅可以由于迁2.5.HPCE的特点电泳在细径(id 2575m)的弹性石英毛细管中进行高电压(1030KV)高电场强度(100500V/cm)毛细管的高电阻限制了电流的产生和发热分离效率高(N105106)时间短2.5.H

15、PCE的特点多种分离模式分离在水相中进行样品量小(150nl)样品前处理相对简单柱上检测多种分离模式仪器自动化无污染仪器自动化2.7.HPCE在中药化学成分分析中的优势与HPLC法相比，HPCE在中药分析中具有下列优越性:(1)高效、快速。分离速度快，几十秒至几分钟间完成;(2)低耗，它几乎不消耗溶剂，分析成本低;(3)分析模式多且仪器较简单，自动化程度高，适合于中药各类成分的分析;(4)采用熔融石英毛细管柱易于全面清洗，柱子不易污染和堵塞;(5)对样品的前处理要求简单。2.7.HPCE在中药化学成分分析中的优势3HPCE在中药分析中的应用3.1.生物碱类生物碱在缓冲体系中大多带有正电荷，一般

16、可用CZE模式，在一定的pH值下实现分离。有时可加入乙腈、甲醇等有机溶剂以改善电泳流和选择性。 3HPCE在中药分析中的应用3.2蒽醌类蒽醌类化合物结构中多有羟基和羧基，用CZE和MECC都能分析。 3.2蒽醌类3.3黄酮类黄酮类化合物一般不带电，多用MECC模式分离测定;也可利用黄酮类化合物含有的邻羟基，与硼砂复合成带电粒子，再用于CZE分离模式。 3.3黄酮类3.4皂苷类皂苷类化合物不带电荷，一般采用MECC分离模式。 3.4皂苷类3.5有机酸类有机酸类成分解离后带负电荷，以CZE模式分析时，在中性成分后出峰，分析时间较长。 3.5有机酸类3.6多糖类糖是生物体内普遍存在的一类重要的化学物质，是植物和动物的能量来源，在很多生命过程中起着重要的作用。由于糖类多数解离程度微弱，且具有较强的亲水性，致使利用样品迁移率差异的毛细管区带电泳和利用样品疏水性差异的胶束毛细管电动色谱都难以直接解决糖的分离问题；其次多数糖类不具备很强的紫外和荧光生色团，使分离后的检测有一定困难。 3.6多糖类4展望HPCE在中药成分分析中的应用虽然起步较晚，但发展十分迅速。它作为一种新的分离手段已应用到药物制剂及原料分析的各个方面，且分离效率高、速度快、操作简便、费用低，在中药及其复方制剂中有着广泛