大肠杆菌基因工程课件

1、基因工程原理何光源2016-04-05第九章 大肠杆菌基因工程第一节 大肠杆菌表达体系第二节 大肠杆菌的表达载体第三节 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达2022/10/15第一节 大肠杆菌表达体系2022/10/15大肠杆菌表达体系基因工程的重要目标之一是，制备按其它方法难以生产的大量纯化的蛋白质产物，为此就需要有一种能够高水平表达异源蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统的选择要考虑多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白质产物转译后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水平和分泌方式等。目前被选作表达异源蛋白质的表达系统有细菌（包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺

2、乳动物细胞等。2022/10/15大肠杆菌表达体系比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性：对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。2022/10/15大肠杆菌表达体系大肠杆菌中表达体系表达真核基因的不足：真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别，在大肠杆菌细胞中不可能具有为真核RNA加工剪辑所需要的酶体系，真核基因很难直接在大肠杆菌细胞中实现功能性表达；真核基因的转录信号同原核

3、不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子；外源基因可能含有具有大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。真核基因mRNA的分子结构同细菌有所差异，影响真核基因mRNA稳定性和同细菌核糖体相结合的能力，从而阻碍正常的转录和翻译；2022/10/15大肠杆菌表达体系许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的修饰作用在细菌细胞中并不存在；细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，将其降解。2022/10/15克隆基因正确表达的基本条件最基本条件：能进行正常的转录和翻译，在正常情况下还与翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。重要条件编码的蛋白质产物应

4、能维持正常的稳定性；具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子； 插入序列的正确取向2022/10/15第二节 大肠杆菌的表达载体大肠杆菌载体系统大肠杆菌表达载体的基本成分常用的大肠杆菌表达载体2022/10/15大肠杆菌克隆载体VectorHostInsert size (kb)plasmidE. coli8 phageE. coli924cosmid E. coli3545P1 phageE. coli70100PACsE. coli100300BACsE coli3002022/10/15大肠杆菌表达载体2022/10/15大肠杆菌表达载体的基本成分组 成 部 分启动子转录终止子

5、翻译起始序列翻译增强子翻译终止子2022/10/15启动子最佳启动子具备的条件：必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%30%以上；应能呈现出一种低限的基础转录水平，具有高度抑制性（抑制型启动子）；应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物得以诱导（诱导型启动子）。2022/10/15转录终止子转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通过下游启动子时，会使该启动子的功能受到抑制，这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象2022/10/15翻译增强子显著的增加异源基因在大

6、肠杆菌中的表达效率翻译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌偏爱终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率将进一步的增强。2022/10/15常用的大肠杆菌表达载体Lac启动子的表达载体Trp启动子的表达载体PL启动子的表达载体2022/10/15Trp启动子的表达载体优点：诱导型，所合成的蛋白质产量高于Lac启动子表达载体系统。生产-干扰素和-干扰素三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元。2022/10/15PL启动子的表达载体使用最广泛的大肠杆菌表达载体之一cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。42时，阻遏蛋白失活；2830 时， PL

7、启动子完全被阻遏蛋白抑制。通过改变温度来控制PL启动子的开关2022/10/15第三节 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达大肠杆菌基因工程菌的构建策略基因工程菌的遗传不稳定性及其对策2022/10/15外源蛋白质在大肠杆菌细胞的表达部位细胞质中表达周质中表达胞外表达2022/10/15大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建2022/10/15包涵体型异源蛋白的表达包涵体表达目的蛋白的优点：简化外源基因表达产物的分离操作水难溶性，密度远大于其它细胞碎片和细胞成分菌体经超声

8、波裂解后，直接通过高速离心，即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来一定程度上保持表达产物的结构稳定 形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁蛋白质没有活性，不会使寄主细胞受伤害2022/10/15包涵体型异源蛋白的表达蛋白质的产量高二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，导致外源基因编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达表达的质粒载体构建比较简单2022/10/15包涵体型异源蛋白的表达包涵体表达目的蛋白的缺点：变性复性操作：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失原有生物活性，无正确空间构象，必须通过有效的变性复性操作，回收具有生物活性的目标蛋白。技术难题-变复性操作的效率，尤其当目

9、标蛋白中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%N-末端存在甲硫氨酸,影响蛋白质的真实性蛋白质种类多，纯化比较复杂2022/10/15包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作包涵体的形成：若未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，倾向于形成包涵体基因操作关键-选择高表达的载体高表达率-包涵体法的优势2022/10/15包涵体的变性与复性操作蛋白质变性复性的动力学原理：N 天然状态的蛋白质U 变性状态的蛋白质C 共价修饰的蛋白质A 集聚状态的蛋白质I 有效变复性过程中的中间状态X 脱离有效变

10、复性过程而进入集聚的中间状态C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAgAgAgAg细菌内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，无活性，包涵体中蛋白质属于这两种状态复性操作：在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）2022/10/15包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性：拆开错配的二硫键和次级键人工条件下，使包涵体溶解、重新进入复性途径。试剂和条件：清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂 尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端pH 廉价，但许多蛋

11、白质在极端pH条件下发生修饰反应2022/10/15包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性2022/10/15包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达2022/1

12、0/15包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式：化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好HSHS S S+2e+2H+AHSHS S-S-RHS+BR-S-S-R S S

13、2R-SH2022/10/15分泌型异源蛋白的表达大肠杆菌中表达的异源蛋白的定位可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；通过运输或分泌方式定位于细胞周质；穿过外膜进入培养基中蛋白质分泌的前提条件-N端信号肽序列的存在2022/10/15分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是细胞质中10倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端不含甲硫氨酸残基。这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基不能被切除。将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，实现分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中有效

14、除去2022/10/15分泌表达形式的缺点：大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全：外源真核生物 基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达少数外源基因能分泌表达，但表达率通常要比包涵体方式低很多产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌并不普遍2022/10/15蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联；与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感 2022/10/15分泌型目的蛋白表达系统的构建绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外；部分革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（

15、细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大；将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适质粒上，构建完全分泌型受体细胞另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化完全分泌型受体细胞，使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌2022/10/15Secretion Cloning Vector2022/10/15融合型异源蛋白的表达异源蛋白的直接表达 融合蛋白：将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个开放阅读框架进行表达，这种杂合基因表达出的蛋白质为融合蛋白；受体细

16、菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端；回收异源蛋白：杂合基因上引入蛋白酶切位点或化学试剂特异性断裂位点，在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白2022/10/15融合表达蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段2022/10/

17、15融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化；外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子；尽可能避免融合蛋白两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件，并不需要完整的受体结构基因；两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，直接决定着融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 2022/10/15融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus泛素蛋白

18、（Ubi） 维持良好空间构象金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析外膜蛋白（OmpF） 促进分泌麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌2022/10/15目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应制备和生产目的蛋白时，需将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法 酶促裂解法 2022/10/15目的蛋白的回收化学断裂法：最佳试剂为溴化氰（CNBr），与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用

19、下肽键断裂，形成两个多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。优点：回收率高 85%以上；专一性强；产生的目的蛋白N端不含甲硫氨酸，接近真核生物细胞中的成熟表达产物如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法2022/10/15目的蛋白的回收酶促裂解法：单残基位点特点：断裂效率更高每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。前提条件：外源蛋白分子内部

20、不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，适合小分子多肽，大分子量的异源蛋白上述三种氨基酸残基的出现频率相当高2022/10/15目的蛋白的回收酶促裂解法：多残基位点为克服单一氨基酸残基酶切位点的局限性寡肽序列-多残基位点：受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，断裂位点在ArgC末端纯化后的融合蛋白用Xa处理，可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物2

21、022/10/15寡聚型异源蛋白的表达从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。重组质粒含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，细胞的正常生长代谢受到影响通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量并不能获得满意的效果。寡聚串联型异源蛋白表达载体的构建：将多拷贝外源基因，克隆在低拷贝质粒上，通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量2022/10/15以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的

22、拷贝数，一定程度上改善表达量稳定表达小分子短肽短肽缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的产物回收困难寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性2022/10/15寡聚型目的蛋白表达系统的构建基本策略：2022/10/15PSDgenegenegenegeneT1 T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr整合型异源蛋白的表达以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳定表达整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在

23、没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，改良物种遗传性状为目的目的基因表达率低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制可通过强化表达元件而加以补偿2022/10/15DNA体内重组的基本原理在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类：转位因子依赖型同源序列依赖型2022/10/15DNA体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族转位因子-生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子噬菌体G片段（G-Fragment） 原核细菌插入顺序（IS） 真

24、核细菌转座子（Tn、Ty） 高等植物可移动因子（Ac、Ds） 高等动物跳跃基因（mobil gene） 2022/10/15DNA体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构2022/10/15IS（1 kb）Ty（5 kb）Tn（220 kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗药性基因转位酶基因识别位点阻遏基因IRIRIRIRISISDNA体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：整合形式2022/10/15DNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：基本形式原核细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离、同源区的

25、长度、同源程度密切相关。距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点2022/10/15DNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源整合2022/10/15ori目的基因同源区域标记基因整合位点染色体DNADNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源交换2022/10/15ori目的基因同源区域标记基因交换区域染色体DNAori标记基因+蛋白酶抗性 / 缺陷型表达系统的构建稳定性：无论在真核生物，还是在原核细胞中，重组目的蛋白都可能被降解，其稳定性常常不如半衰期较短的内源性蛋白质。

26、不稳定性根源：对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。解决：通过蛋白序列的人工设计 受体细胞的改造2022/10/15蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lon -）：大多数不稳定的重组目的蛋白被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解，分别由lon和clp基因编码，蛋白水解活性依赖于ATPlon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。lon -的大肠杆菌突变株可使半衰期较短的细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，被广泛用作外源基因高效表达的受体菌2022/10/15蛋白酶缺陷型受体细胞的改造htpR基因缺陷

27、的大肠杆菌受体（htpR-）：大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族：降解异常或异源蛋白，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象，提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是lon-htpR-的双缺陷株，非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。2022/10/15抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响极性氨基酸，天门冬氨酸Asp对提高蛋白质稳定性的效应最显著，Asp残基离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大在多种

28、结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基，能显著地延长蛋白质的半衰期2022/10/15抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响：多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，蛋白质的稳定性显著改善。N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶的超敏感区2022/10/15基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略2022/10/15基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的表现形式主要表现在重组质粒的不稳定性，两种表现形式结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失分配不稳定性整个重组DNA