雪里蕻抗氧化方法

1、雪里蕻抗氧化能力的研究雪里蕻抗氧化活性成分的提取流程雪里蕻干燥-粉碎-分别用甲醇、75%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、水索氏浸提 2次提取液浓缩一浓缩液（保存备用）还原力测定将提取物配成不同浓度，吸取2.5mL，加入2.5mL磷酸 缓 冲 溶 液 （pH6.6,0.2mol/L ）及 2.5mL, 1%K Fe（CN），置 50C恒温水浴中反应 20min 后迅速冷却，再加入2.5mL10%的三氯醋酸，混合后离心，取上清液5mL,加入5mL 去离子水，1mL0.1%FeCl溶液。混合均匀，1min后于700nm处测其吸光值，以 去离子水作为空白。3提取物清除羟自由基的抗氧化能力测定采用H2O2/邻二氮

2、菲一Fe2 +分光光度法，参照文献的改进，以蒸馏水将75 mmol/ L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释至18.75 mmol/ L ,依次往25 ml容量瓶 中加入提取物,18.75 mmol/ L邻二氮菲溶液1.0 ml ,pH 7.4磷酸盐缓冲液2 ml ,18.75 mmol/ L FeSO4 溶液 1.0 ml ,1 %（体积分数）过氧化氢 110 ml ,以 蒸馏水补充至25. 00 ml。每加一次试剂均需混匀，在恒温水浴锅37 C恒温1 h后在510 nm波长处测定吸光度，用蒸馏水作空白。既加提取物溶液，又加过 氧化氢为测试样品A1 ;不加提取物溶液，只加过氧化氢为损伤液A损；不加提 取

3、物溶液，也不加过氧化氢为末损伤液A末；只加药液和蒸馏水，不加其它溶 液为测试样校对液A校，A = A1 - A校。按下式计算表观羟自由基清除率： d = （A - A 损）/ （A 末-A 损）X100 %。提取物清除O2- 的抗氧化能力测定用pH值为7.4的混合磷酸盐缓冲溶液作溶剂，配制含3.3 X10 - 6mol/ L 核黄素，0.01mol/ L蛋氨酸，4.6 X10 - 5mol/ L NBT的自由基体系注：自由基 体系需现用现配且避光保存，光照灯为40W白炽灯，烧杯距灯1012cm ,用 50mL烧杯各取10mL自由基体系和提取的乙醇提取液，在25 C下，置于光照 箱中光照30mi

4、n ,以蒸馏水作为参比液，在确定的最大吸收波长560nm处测定 提取液的吸光度A，同时以水代替提取物测定空白吸光度A0，按下式计算乙醇 提取液清除02- 的抗氧化能力。清除率 % =A 2- AX100fA 0提取物清除2,2 -连氮双（3乙基苯并噻唑啉-6磺酸）二氨盐（ABTS）ABTS自由基清除能力测定参照Thana等的方法 配制终浓度为7 mmol/LABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾的混合液室温避光条件下静置过夜（12 h）制得ABTS自由基储存液，使用时用水稀释至734 nm处吸光度为0.70+ 0.02的应用液。100uL待测液加入3 mL ABTS应用液充分混合室温下避光

5、反应6 min后测定其在734 nm处的测吸光度计算公式ABTS自由基清除率% 二（Ablank-Asample）* 100/Ablank5.提取物抗脂质过氧化能力的测定（对卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸（PUFA）体系所产生的ROO抑制能力）以Fe2诱导卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸（PUFA）发生脂质过氧化反应为模型新 鲜卵黄用等浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液PBS（pH值为7.4）配成悬液， 再稀释25倍，磁力搅拌器搅拌30 min,（新鲜卵黄用等体积的0.2 mol/L pH 7.4的PBS按1 : 1配成悬液，再稀释成1 : 25（卵 黄：总体积），磁力搅拌30 min。）精确移取0.4 m

6、L,注入25 mL具塞试管中，再依次加入不同浓度的样品提取 液（对照管加入相同体积的PBS ） 0.2 mL, 25 mmol/L的FeCl2溶液0.2 mL, 用PBS补足2.0mL置于37C水浴中振荡50 min,取出，加入质量分数为20% 的三氯乙酸0.50 mL终止反应，静置10 min, 3 000 r/min离心15 min取上 清液2.0mL，加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸溶液1.0mL，于沸水中反应15 min,冷却，于532 nm处测定吸光度A值，以下式计算抑制率抑制率二A对照-A样品X100 %A对照75 mmol/ L 邻二氮菲（C12H8N2H2O198.22）无水

7、乙醇溶液：称取 0.743g的邻二氮菲溶于50ml的无水乙醇中18.75 mmol/ L邻二氮菲无水乙醇溶液：于75 mmol/ L邻二氮菲无水乙醇溶液 加蒸馏水到200ml,摇匀（每次用1.0 ml）pH 2. 0的HCl溶液：取1.67ml的12mol/L的浓盐酸稀释到1000mlp H 4. 0的乙酸盐缓冲液：0.05mol/L 醋酸一0.05mol/L 醋酸钠（16.4: 3.6）。摇匀，即得。p H 6. 0的磷酸氢钾-磷酸二氢钾缓冲液：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml,即得p H 7. 4的磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾6.8g,加0.1mol/L

8、氢氧化钠溶液400ml,用水稀释至1000ml，即得。p H 6. 88的磷酸盐缓冲溶液,:取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml, 摇匀，即得。pH 8. 710. 8的碳酸盐缓冲液：称取1.59g碳酸钠（Na2CO3）, 2.93g碳酸氢钠（NaHCO3），加水稀释至1000mL 摇匀，即得。3.3 X10 - 6mol/ L核黄素（C17H20N4O6 ） 376.36 本品在水、乙醇、氯仿 或乙醚中几乎不溶；在稀氢氧化钠溶液中溶解。取1.242mg溶于PH=7.4磷酸盐 缓冲溶液（每次用10ml）0.01mol/ L

9、 蛋氨酸 （C5H11O2NS 149.21 ）溶于水（3.3g/100ml,25 C ）、 稀酸和稀碱。极难溶于乙醇，几乎不溶于乙醚。:取1.492g溶于PH=7.4磷酸盐 缓冲溶液（每次用10ml）4.6 X10 - 5mol/ L NBT 氯化硝基四氮唑蓝 817.60:取 37.61mg 溶于 PH=7.4 磷酸盐缓冲溶液（每次用10ml）然后用PH=7.4磷酸盐缓冲溶液定容核黄素蛋氨酸NBT的混合液到1000ml7 mmol/LABTS C18H24N6O6S4 548.68:取 1.15223mg 溶于蒸馏水中 （每次用3 mL ）2.45 mmol/L过硫酸钾270.32 :取198.6852mg溶于蒸馏水中（每次用3ml）然后用蒸馏水定容ABTS过硫酸钾混合液到300ml0.2 mol/L新鲜卵黄（卵黄脂蛋白）一种磷脂蛋白（约135 kDa），鸟卵蛋黄中的 主要组分，与其共存的有卵黄高磷蛋白，两者在肝脏中以一个大分子质量前体蛋白 质的形式（卵黄原蛋白）合成。需要用量 54g溶于水？中得2ml -稀释25倍 得50ml（每次用稀释25倍0.4 mL ）25 mmol/L 的 FeCl2 溶液（四水）198.8102 g :取 99.