重组DNA1技术1课件

1、重组DNA技术(1)DNA Recombination technology (1)杨 敏 检验医学院临床生物化学教研室临床分子诊断学-技术篇2课前复习1.核酸分离纯化的原则是什么？2. 核酸分离纯化的基本步骤？核酸的分离与纯化核酸分离、纯化原则 保持核酸分子一级结构的完整性 保证纯度分离提取核酸的主要步骤 核酸的释放：细胞的破碎 核蛋白的解聚、变性，蛋白质的去除 核酸的浓缩、沉淀和洗涤 核酸的浓度测定 核酸的保存DNA知识回顾DNA and RNA are large macromolecules with several levels of complexityNucleotides fo

2、rm the repeating unitsPhosphodiester bonds link nucleotides to form a strand Two strands interact to form a double helixThe double helix interacts withproteins resulting in 3-D structuresin the form of chromatin NUCLEIC ACID STRUCTURE3D structureBase + sugar nucleoside ExampleAdenine + ribose = Aden

3、osineAdenine + deoxyribose = DeoxyadenosineBase + sugar + phosphate(s) nucleotideExample Adenosine monophosphate (AMP)Adenosine diphosphate (ADP)Adenosine triphosphate (ATP)Combining all the partsThe structure of nucleotides found in (a) DNA and (b) RNAA, G, C or TA, G, C or UdNMPNMPNucleotide Polym

4、erization Reaction: Phosphodiester Bond FormationCopyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or displayWrite the strand complementary to: 5 ACTAGCCTAAGTCG 3Answer3 TGATCGGATTCAGC 55 CGACTTAGGCTAGT 33 GCTGAATCCGATCA 5Rotation要求掌握重组DNA技术、限制性内切酶、载体的概念，分子克隆的基本步骤。熟悉常用的D

5、NA连接酶、DNA聚合酶等工具酶，常用载体的特点。了解重组 DNA技术的应用。DigestionFragment recoveryLigationTransformationSelectionAmplificationPlasmid preparation Protein expression 重组DNA技术：Recombinant DNA technology是指用酶学的方法将目的DNA在体外重组于自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行扩增和繁殖，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。常称作分子克隆（molecul

6、ar cloning）技术或基因工程(gene engineering)技术。DNA克隆克隆（clone）： 细胞通过无性繁殖后产生的与亲代细胞完全相同的子代群体，来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化（cloning）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。分子克隆（DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I逆转录酶Taq DNA聚合酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶末端转移酶S1核酸酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）所有工具酶中最为重要，是一类识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA

7、双链结构的核酸内切酶，是细菌内存在的保护性酶。与对应的甲基化酶共同组成了细菌内的限制修饰系统。Restriction Endonucleases: Type IIEnzymeIsolated fromRecognition sequenceEco RIE. coli, strain R, 1st enzymeGAATTCEco RVE. coli, strain R, 5th enzymeGATATCHind IIIH. Influenzae（流感嗜血杆菌）, strain d, 3rd enzymeAAGCTTThere are hundreds of Hydrolyze 3,5-phosp

8、hodiester bond Recognition site, cutting style & end type of EcoRICut DNA in the interior双轴对称回文结构palindrome 5533GAATTCGAATTCNNNN5-overhang5-overhangEnzymeSequenceCut FrequencySau3AIEcoRINotI5-GATC-35-GAATTC-35-GCGGCCGC-30.25kb4kb65kbFrequency=(1/4)n , where n=the number of bps in the recognition seq

9、uenceP76改错BamH1 GGATCCCCTAGGHaeIIIGGCCCCGGCohesive Ends(5 Overhang)Cohesive Ends(3 Overhang)KpnI GGTACCCCATGGBlunt Ends(No Overhang)Restriction EnzymesGATCCTAGDpnI(Requires methylation)Methylation-sensitive EnzymesGGCCCCGGHaeIII(Inhibited by methylation)CCCGGGGGGCCCXmaI(5 Overhang)CCCGGGGGGCCCSmaI(B

10、lunt Ends)IsoschizomersEnzymes GeneratingCompatible Cohesive EndsGGATCCCCTAGGBamHI(5 Overhang)AGATCTTCTAGABglII(5 Overhang)CTCGTGGAGCACBssSI(5 Overhang)NNCAGTGNNNNGTCACNNTspRI(3 Overhang)Enzymes RecognizingNon palindromic SequencesRestriction Enzymes部分常用限制性内切酶特异识别:4或6个碱基回文结构特异切割5突出黏末端5-overhangcohes

11、ive end 3突出黏末端3-overhangcohesive end 平末端blunt end 同序同切酶 同序异切酶 同 裂 酶同 尾 酶Compatible end可配伍的末端制备可控特异片段5-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG -3只写出了一条链的序列信息。找一找5-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGG

12、GGG -3只写出了一条链的序列信息。选取的是载体上的多克隆位点。正确答案？Restriction enzyme analyse by NEB Cutter举例说明限制性内切酶反应的设置DNA 1 g10 x NEB buffer 3 10 L100 x BSA 1 LBamHI 1 unitH2O 补充体积至100 L最适反应温度下保温适当时间。100ul 反应限制性内切酶反应的影响因素DNA 的纯度和结构反应缓冲液的pH及离子浓度酶解温度和时间限制酶限制性内切酶在DNA重组技术中的应用改造和组建质粒组建基因组DNA物理图谱基因组DNA同源性研究DNA重组克隆及亚克隆DNA杂交与序列分析分析

13、限制性片段长度多态性Restriction fragment length polymorphism, RFLPRestriction Enzyme MappingBamH1XhoIXhoI1.1 kb1.7 kb1.2 kb2.8 kb4.3 kb3.7 kb2.3 kb1.9 kb1.4 kb1.3 kb0.7 kbBamH1XhoIBamH1XhoI4.0 kb2.8 kb1.2 kb1.7 kb1.2 kb1.1 kb还有其它可能性 ?DNA ligaseDNA连接酶是一种封闭DNA链上切口的酶，它借助ATP 或NAD（辅酶I，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ）水解提供的能量催化一段DNA链上临

14、近的5磷酸末端和3羟基末端生成磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起，从而封闭双链DNA上的切口。35磷酸二酯键nickT4 DNA ligase: rATP, 互补的粘性末端，平末端E.Coli DNA ligase: NAD, 互补的粘性末端，平末端两类常用DNA连接酶及其辅助因子焦磷酸部分AMP部分AMP部分NMN部分rATPNAD+连接机制：3步骤NADNMNDNA-腺苷酸 激活赖氨酸的-氨基切口(nick)与缺口(gap)的区别G ATTCCTTA GG AATTCCTTAT Gnickgap可连接不可连接磷酸二酯键断裂 核苷酸缺失 效率高效率低 粘性末端连接Sticky ends

15、must match (be complementary) for optimal re-ligation.Sticky ends can be converted to blunt ends with nuclease or polymerase. Blunt ends can be converted to sticky ends by ligating to synthetic adaptors.Blunt ends can be re-ligated with less efficiency than sticky ends.Ligation of Restriction Enzyme

16、 Digested DNAEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIEcoRIBamHIBamHI 如何筛选我们想要的质粒？如何通过克隆策略设计增加获得想 要质粒的机会？Question?影响连接酶效率的因素rATP/NADMg2+DTTpH 7.27.4DNA Polymerase催化以DNA为模板合成DNA的反应，主要用于DNA的体外合成。共同特点：催化在带引物的双链DNA分子的3羟基端加上脱氧核苷酸，合成方向对应于被合成链而言从5端到3端延伸，形成新的DNA链。反应需要4种脱氧核糖核苷酸和Mg2+53 聚合酶活

17、性 a53外切酶活性 b35外切酶活性 c大肠埃希菌DNA聚合酶I: abc； 缺口平移法标记，3黏性末端标记、平端化，cDNA合成大肠埃希菌DNA聚合酶I Klenow 大片段: ac；补齐， 3末端标记耐热Taq DNA 聚合酶： ab, 微弱的非模板依赖的末端转移酶活性，耐高温；PCR, TA-cloning逆转录酶：ab, 以mRNA为模板合成cDNA;降解RNA:DNA中的RNA；用于构建cDNA文库T4 DNA 聚合酶：ac；补齐末端，标记T7 DNA 聚合酶：ac；序列分析；测序酶GAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCEcoRIPstI AATTC GCTGCAGEco

18、RIPstIDigestionEnd Blutting AATTC TTAAGCGT4-DNA polymerase+dNTPIdentifying Natural Product Biosynthetic Genes from a Soil Metagenome by Using T7 Phage Selection Zhang K, He J, Yang M, Yen M, Yin J. Chembiochem. 2009, 10(16):2599-2606.反转录酶 reverse transcriptase碱性磷酸酶Alkaline phosphatase催化去除DNA、RNA、dNTP或NTP上的5端磷酸基团，方便5端标记同位素，防止连接反应时载体的自身连接。细菌碱性磷酸酶Bacterial