PCR实验检测标准操作规范

1、PCR 检测实验室操作规矩一、PCR 实验室的设置及管理负责人：本实验室采用实时荧光定量（定性（第三区）。每一工 作各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP 文件。一工作区。进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区） 需首先熟悉本程序的各项规则并且严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。实验完毕后做好清洁消毒工作。二、PCR 实验室工作制度及纠纷的发生。适用范围：一切本实验室人员。细则：各区的用品不得混用。试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP 文件)。RNAcNA 的合成（见相关SOP）。扩增分析区只能进行NA 或 cNA 的扩增、实时荧光PCR 扩增产物的

2、分析（见相关与维修。爱护科室财产，注意安全；离开实验室前应关好门窗，检查水、电等。三、PCR 实验室内务管理制度目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。适用范围：实验室相关人员及相关清洁工人。负责人：细则：非本室工作人员未经允许不得进入实验室。各区的用品不得混用。实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。一切仪器（如PCR 扩增仪）各区的各种清洁消毒均应有记录，工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。4。 10四、PCR 实验室人员的配置及管理目的：保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。适用范围：适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。人员要求以上学历。实

3、验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR 技术培训，并且取得合格证。关于于新进入本室的人员，如尚未取得PCR 人员配置实验室应根据工作需要配备足够的工作人员。人员培训及考核实验室负责人或负责人指定人员参加每年卫生部PCR 室间质评总结会。12 1 次PCR 安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。科室不定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识，提升自身a)日常工作质量b）室内质控测评c)室间质控测评)在报怨处理中的表现a） 工 作 质 量 高 ， 质 控 测 评 成 绩 优 秀 者b）有科研能力，并且有一定数量和质量的论文发表c)有独创性工作成果

4、，经鉴定认可者）受到有关部门或群众嘉奖者有下列情况者将受到惩处：b行。训和提高，关于于不适合本室工作的人员要即时调离。人员管理果、培训等相关材料复印件。技术档案分文本档案和电子档案，文本档案每年更新1 次，电子档案随时更新。五、PCR 实验室清洁程序负责人：操作人：细则：实验室地面必需平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。处，常用的物品要容易寻找到。2751 次关于移液器咀进行 75%实验进程中如发生标本或试剂外溅,应立即用 2酒精擦洗，并且用移动紫外灯消毒。（关于实验台面消毒）、天花板紫外灯消毒实验室，每次开启 3060 分钟。一方向流程的原则来进行清洁。处理好各区废弃物。每周将工

5、作服洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。六、PCR 标本唯一标识编号规则负责人： 操作人：程序：按检测日期分类标记根据标本送检的日期,每天的标本关于应标记一种唯一的代号.按检测类型分类标记根据检测项目的不同,每种检测项目关于应标记一种唯一的代号。按验单接受顺序编号在同种检测类型的验单中，按验单顺序编号。特殊标本的编号如有特殊情况，应在标记前面增加特异字母区别开。编号步骤a）关于当天送来的标本,根据编号的基本原则编号，每个样本的每个检测项目关于应一个唯一的编号.用笔在每张试验申请单和关于应的样本管上作好相同的标记。一统编号等。f)扩增得到结果后，先在统计簿上填入结果，作好记录,再一一把实验结果

6、填入相应申请单. g）发放试验报告单。七、PCR 基因扩增实验室的要求负责人：操作人：程序：一、临床基因扩增试验实验室的设计（一）4 个区域在物理空间上必需是完全相互独力的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分PCR1。试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反映混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。2。标本制备区:核酸（RNA、NA)提取、贮存及其加入至扩增反映管。关于于涉及临床样本的操作，应契合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规矩的要求。3。扩增区：cNA 合成、NA 扩增及检测。4。扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切

7、电泳、变性高效液相分析、测序等。（二）临床基因扩增试验实验室的空气流向。临床基因扩增试验实验室的空气流向可 向空气压力递减的方式进行。可经过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。（三）工作区域仪器设备配置标准。（1）28和-20以下冰箱.（2)混匀器.(3） 微 量 加 样 器 （ 覆 盖 21000l）. (4）可移动紫外灯（近工作台面 (5）（6）专用工作服和工作鞋(套)。(7）专用办公用品。-80（2)高速离心机.（3)混匀器。（4)水浴箱或加热模块。微量加样器（0.2-1000l）。可移动紫外灯（近工作台面） 。(7）生物安全柜。（8）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加

8、样器吸头(带滤芯）。(9）专用工作服和工作鞋(套)。专用办公用品。如需处理大分子NA3。扩增区。（1）核酸扩增仪。（2)微量加样器(覆盖 0.2-1000l），(视情况定）。（3)可移动紫外灯(近工作台面)。（4）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯）。(5）专用工作服和工作鞋. (6)专用办公用品。4。扩增产物分析区.视试验方法不同而定，基本配置如下:（1)微量加样器（覆盖 0.21000l）。（2)可移动紫外灯（近工作台面).（3)消耗品:一次性手套、加样器吸头（带滤芯）.（4)专用工作服和工作鞋。（5)专用办公用品。上述各区域仪器设备配备为基本配备，实验室应当根据自

9、己使用的扩增检测技术或试剂的特点，关于仪器设备进行必要的增减。二、临床基因扩增试验实验室工作基本原则（一)进入各工作区域应当严格依照单一方向进行，即试剂储存和准备区标本制备区扩增区 扩增产物分析区。(二)各工作区域必需有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。（三）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。(四）实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。(五)工作结束后，必需立即关于工作区进行清洁.工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的

10、消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量关于去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm 波长)，在工作完成后调至实验台上 6090cm 内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基关于（bp），关于紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必需延长照射时间，最好是照射过夜。（六）实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，一切操作契合实验室生物安全通用要求（GB19489-2008).三、临床基因扩增试验实验室各区域工作注意事项(一）（三）(四)扩增产物分析区。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）

11、Southern 转移、核酸测序方法、质谱分析等。本区是最主要的扩增产物污染来PCRELISA 方法检测1 mol/L HCl倒，而应当至远离PCR1 mol/L HCl由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应当注意实验人员的安全防护。八、PCR 废弃物的处理程序ETA负责人：操作人：细则：4。1 科室职责应关于本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传递途径中的重要性，并且要求严格执行。4。2 实验室一切垃圾，装入专用污物袋内，各区备有：生活垃圾袋（黑色)及生物污染垃圾袋（黄色）。使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、等），

12、先放入10%次氯酸钠溶液中浸泡 24 小时后，再放入黄色垃圾袋内，使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋内集中处理.4.3应重新灭菌，金属工具可烧灼灭菌或消毒液浸泡；玻璃制品干热或压力蒸汽灭菌。4。4 一次性塑料痰盂，用 2%戊二醛液浸泡 24 小时后，放入黄色垃圾袋内集中处理。4。5 废弃标本如血、尿、胸水、腹水、脑脊液、唾液、胃液、肠液、关节腔液等用10%的 84 液浸泡 24 小时后,集中处理。处理；关于可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15 分钟或加入 10次氯酸钠溶液浸泡24 小时,消毒液每日更换，消毒后用洗涤剂及流水刷洗,沥干,用于微生物培养采样者，用压力蒸汽灭菌后备用。九、基

13、因扩增检测实验及结果分析1、目的:保证扩增及结果分析的标准化、规矩化。负责:操作人：4、标准程序：。8发，查找原因，重做实验。4.3。1 阴性关于照出现扩增.4。3.2 阳性关于照无扩增。3 大批甚至一切的标本都扩增了。4。3。4 室内质控血清检测结果出现失控情况,实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程序.4.4。1 阴性关于照没有扩增，阳性关于照扩增.4.4。2 阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内.4。43 室内质控血清检测结果处于在控状态，具体标准详见十、临床标本的保存操作程序适用范围：分子诊断室的一切临床检测标本。负责人：操作人：处理前的标本保存4

14、下短期（24h 内），下。b）咽拭子、痰或胸腹水、脑脊液、脓液标本短保存于-70下.a） 提取的核酸标本当天检测可置 4保存，如当天不检测应置-20保存。报告发出后第二天丢弃。/1 个星期，以备复查。超过 c）血清/血浆标本放置低温冰箱保存时须有记录，按编号顺序存放，并且由专人负责管理.特殊标本的处理：十一、临床标本的采集、运送、接受程序目的：规矩临床待检标本的正确采集、送检和处理。适用范围：分子诊断室的一切临床检测标本。负责:操作人：程序：标本的采集护人员采集并且送至实验室。标本采集要求2ml 真空采集管或 。5ml 高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2 小时内送达实验室。离心（试验

15、单与标本一道）1.5ml45100g/L NaCl 水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；关于于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。24 小时。标本的运送标本采集后，密闭、标（贴)姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2 小时以上，必需用冰盒送至实验室。接受样本一律退回，并且有书面记录。十二、PCR 生物安全防护措施目的：预防工作人员在实验进程中被感染或污染。适用范围：适用于本室一切工作人员。负责人：操作:细则：每天更换废液缸的 2戊二醛溶液，并且保证 2配置消毒液时，正确量取足量的消毒剂（用量杯,保证浓度），水的用量也要正确，缸体

16、密封性良好。75%的酒精擦拭。3060 分钟，如有需要可延长照射时间。本容器应完好无泄漏。处理标本时应穿工作服、戴手套，以免沾上皮肤。如手或其它部位的皮肤沾上血液或体 （血液、体液）或试剂不慎溅入眼内应立即用清水洗。在实验进程中病人标本（血液、体液)外漏时，应立即用 2上半小时，然后用酒精擦洗，并且用紫外灯消毒。实验完毕后应关于实验室进行紫外消毒。十三、PCR 实验室化学试剂配制程序:4%NaOH 溶液、75%酒精、消毒剂（尿酸或 二氯异氰尿酸钠）2戊二醛溶液等。负责人：操作人：程序：化学试剂的配制：250ml 量桶一只，1000ml 量桶一只,1000ml 烧杯一只，三角烧瓶,100ml20

17、00ml 广口瓶各一只。4NaOHa）用天平称取 4 克分析纯的NaOH 固体,置于一只三角烧瓶中。250ml100ml 水，缓缓注入盛放NaOH 固体的三角烧瓶中。c）摇荡三角烧瓶使NaOH 固体充分溶解。)然后缓缓倾倒入 100ml 塑料试剂瓶中密封保存备用。一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯达到500mg/L，即可达到消毒作用。 b）消毒剂为粉状 克袋），500g1000mlc）如需加大消毒力度,则有效氯浓度加大。220ml1000ml980ml1000ml2000ml14 天十四、PCR 应急处理程序负责人：能、要求、维持和保养、常见故障的排除、尤其要严格依照操作规程操作。检查核实

18、应急措施的有效性。仪器设备故障偶发现象或确属不能立即排除的故障。用红牌故障标志标示故障仪器，以防被错误使用。有满足要求的替用设备的，启用替用设备（准用仪器必需同时满足实验室管理措施（特别是防污染）的要求。供应方技术支持人员将在规则的时间内随身携带备用设备到达现场。色故障标示（暂停使用），换上蓝色正常标示（正常使用）。科室主任须检查并且随时跟踪所采取措施的有效性。质量检测，合格后方可使用。标本送至其它已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增试验实验室检。影响到检测报告发出的情况，应在应急处理记录表作记录。十五、试剂的质检标准操作程序目的：保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，契合要求。适用范围：各

19、种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂。负责人：操作人：程序：核关于试剂品种和数量并且检查包装：外包装（内包装（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。验.效验实验：要求设置：空白关于照、阴性关于照、阳性关于照、室内质控各一，阳性标准品梯度（10101010）。4568a)空白关于照出现扩增.如扩增曲线CT25，需反复实验确证试剂污染。取液阳性关于照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。阳性关于照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线鲜明系统性CT 值偏大 5 个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准

20、品后该批试剂方可投入使用。99）十六、离心机操作维持程序适用范围：适用于本室使用的普通离心机。负责人：操作人：5程序：旋动定时旋钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节旋钮使仪器转速达到预定要求。(70水混合物或乙醇去污染）清洁离心室；离心室内的橡胶密封圈经去污 6. 仪器维持（1) 为确保安全和离心效果，仪器必需放置在坚固水平的台面上，塑料盖门上不得放置任何物品,样本必需关于称放置，并且在开机前确保已拧紧螺母。(2） 应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹，老化等现象，如有须即时更换.（3） 试验完毕后,需将仪器擦拭干净，以防侵蚀。（4) 如样本比重超过 1.2g/cm3，最高转速 n 按下式计算

21、：n=nmax*-1.2/样吕比重。（5） 当电机碳刷长度小于 6mm 时，必需即时更换。(6） 在离心机未停稳时不得开盖。关.(9） 该仪器在日常使用中请注意契合“5.6，5。7”要求. (10） 严格依照仪器的开关机程序关机.7。 期间核查(1)本仪器不需要特别的周期间隔。（2） 校准物均为与ICSH 之标准相契合的校准物,测定值偏差均不超过其规则值。十七、冰箱操作维持规程目的：关于冰箱进行适当的维持，以确保冰箱的正常使用。适用范围：本实验室使用的各种品牌、型号的冰箱。:5程序：开、关机：冰箱按说明书要求放好后，插上电源线,冷藏室温度开关置于 4度开关置于 20，2好的接地线。冰箱内禁止存

22、放与本实验室无关的物品。源,用软布蘸水擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂。每日观察冰箱内温度并且记录于冰箱的质控图上。若温度超出规则范围，调节温控使其回到正常范围，并且进行记录。若温控调节无效，报请设备科维修，修理后须验收合格并且签字后方能正常使用。仪器维持(1） 使用注意.该仪器在日常使用中请注意契合“4。 注意事项”要求(2） 废液瓶满要即时倒掉废液,切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气， 防止低真空出现。(3） 当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。(4） 严格依照仪器的关机程序关机。期间核查（1 冰箱不需要特别的周期间隔.（2) 校准物均为与ICSH 之标准相契合的校准物

23、，测定值偏差均不超过其规则值。十八、生物安全柜操作维持规程目的：正确使用生物安全柜。SOP 适用于本实验室使用的生物安全柜。负责人：操作:4。 性能参数:见说明书。认真进行清洁工作。1530 分钟同时开启紫外灯和风机组工作。均由指示灯指示其工作状态。工作台面上禁止存放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。 分钟后关闭紫外灯，关闭生物安全柜电源。每次使用生物安全柜后，均需关于其进行清洁。根据环境洁净程度，定期将预过滤器中的滤料拆下清洗，一般间隔时间为36 个月。定期（1 次）0.3m/s,则必需更换高效空气过滤器（由厂家或院仪器维修人员进行）.49 有相应的维持记录,长期不使用的生物安全

24、柜拨下电源插头。6。 仪器维持 注意事项”要求（2) 废液瓶满要即时倒掉废液,切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气， 防止低真空出现。（3) 当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。(4） 严格依照仪器的关机程序关机.7。 期间核查(1）PE-5700 基因扩增仪的定标不需要特别的周期间隔,本实验室 PE-5700 基因扩增仪执行卫生部临床试验中心的指定校准。校准物均为与ICSH 之标准相契合的校准物，测定值偏差均不超过其规则值。十九、移液器操作维持规程适用范围：本实验室使用的可调式移液器。程序：移液器的使用装上配套的Tip.前进移液法a） 将按钮压至第一停点位置;b ）23mm轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。约1）松开按钮使之回到起点位置。需要时，可更换管嘴继续移液操作.a） 将操作按钮向下压至第二停点位置。b）将移液管管嘴浸入试剂瓶液面下23mm 深处,然后慢慢松开钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面