动物细胞和肿瘤细胞的培养课件

1、第五章正常细胞和肿瘤细胞培养 细胞培养技术第一节 正常细胞培养正常细胞，不论是来自人或动物的细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。正常细胞难培养的原因是因它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格，目前的培养条件尚未能模拟到与体内完全一样，故难生长，尤其难于维持在体外长时间增殖生长(呈细胞系状态)。肝细胞的培养肝实质由大量肝细胞和少量间质组成，人胎儿、成人和动物的肝脏皆可用于培养；肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。肝细胞形态规整，有多种功能并具有代谢活化致癌物的能力，适于做多种研究。实验步骤：1.把肝组织切成2-4立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS 液洗两次；2.

2、移入1:1 的0.1胰蛋白酶和0.1胶原酶(都用无钙镁BSS 配制) 中，4冷消化10 -12 小时后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可)；3.收集细胞、BSS 液洗1-2 次、计数、接种培养。内皮细胞培养内皮细胞易于从血管分离进行培养成单层细胞，对研究内皮细胞再生长、肿瘤促血管生长因子(TAF)等有很大应用价值。人内皮细胞培养可应用人脐带脐静脉、动物大动脉等，用灌流消化法获取细胞最为简便。注意事项：1.内皮细胞生长后，开始细胞成梭形，类成纤维细胞，连接成片后始显内皮细胞形状。2.首次用胶原酶消化时，应做预试验，以找出最佳消化时间，以防止消化不足细胞末脱落，也

3、避免因消化过度使内皮细胞底层成纤维细胞混入。3.结扎口紧，防止消化液消化外皮细胞。4.人脐带易于获得，培养效果好；细胞生长后，一般传6-7 代后即衰退，难以长期维持。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2-3周，因之多用作初代培养。巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr. 1 等，均已获恶性。巨噬细胞培养培养方法： 1.实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫经乙酸肉汤1ml ；2.引颈杀死动物；手提鼠尾将

4、全鼠浸入70酒精中3-5 秒；3.置动物于解剖台上，用70酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动；4.用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内；5.小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000rpm 离心10 分钟后，去上清，加10 ml Eagle 培养基；6.计数细胞，每只小鼠可产生20 30106 细胞，其中90为巨噬细胞。注意事项：获的巨噬细胞群中，多混有其它细胞成分，如淋巴细胞、中性细胞、血小板和成纤维细胞等，可利用大多数单核巨噬细胞能易附着的特性，使用附着分离法将其他细胞除去

5、。在先把细胞群置于玻璃培养容器中数小时后，巨噬细胞能最先附着于玻璃表面，此时再用培养液或PBS 冲洗掉尚未附着的中性粒细胞和激活的T 淋巴细胞等，剩余巨噬细胞纯度可达95。可继续延长时间至24 小时，此时大多数巨噬细胞都已附着于瓶壁，而中性粒细胞可变性死亡。继之再从瓶壁上把巨噬细胞分离下来进行培养，便获得纯净巨噬细胞。一、肿瘤细胞体外培养的特点细胞保持永生性：自我复制形态学：大小不一 逐渐一致突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制，高分化变低分化增殖力更强接触抑制减弱或消失成瘤性：移植到动物体内可成瘤体外肿瘤细胞培养不受体内环境因素影响，避免个体差异性，便于探索各种理化和生物因素对肿瘤细胞生命

6、活动的影响。第二节 肿瘤细胞培养2.培养特征(1)营养要求不高，在无血清或低血清条件下仍能生长。(2)能自分泌促增殖因子，软琼脂培养单个细胞能形成集落。(3)生长方向性消失，失去接触抑制，数量增多时可呈多层重叠生长。(4)细胞饱和密度大，分裂指数高，细胞倍增周期短。肿瘤细胞失去密度依赖抑制或者接触抑制能力，不需要依附于固定表面，不受密度限制，可持续分裂增殖，形成多层堆积。3永生性(1)永生性（immortality）也称不死性，体外培养表现为可无限传代而不死亡，体外培养的肿瘤细胞系、株都具有这种特性。(2)体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性（包括侵润性）是两种性状，受不同基因调控。(3)多数恶性

7、肿瘤在体外培养时并不那么容易成功，永生性是在体外培养后获得的。5异质性(1)所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性细胞。(2)肿瘤的异质性是指同一肿瘤在组织结构和功能性质上是由不同性质的细胞所组成的。(3)其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分。6细胞遗传性 体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈异倍体或多倍体生长。1.细胞种类：肝癌HepG2细胞株；2.培养的天数：培养3天；3.放大倍速：倒置显微镜，20倍；4.培养基种类：DMEM（高糖型）+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈不规则

8、多边形贴壁生长 细胞种类：淋巴瘤细胞U937培养的天数：2d；放大倍速：倒置显微镜 X10；培养基种类：1640+10%胎牛血清；细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，悬浮生长 细胞种类：人前列腺癌细胞PC-3培养的天数：3d；放大倍速：倒置显微镜 X10；培养基种类：1640+10%X小牛血清；细胞状态与特征简述:细胞呈不规则梭形，贴壁生长 细胞种类：人肺癌细胞A549；培养的天数：1d4d；放大倍速：倒置显微镜 X10；培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，贴壁生长1.实体瘤取材方法： 取术后或活检切取的标本立即浸入无血清培养液并及时进行培养。尽可能去除溃疡及坏死组织，避免污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含两性霉素B 、青霉素、链霉素的培养液中浸泡1020分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。2.体腔液取材方法：在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝剂，可直接离心收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。3.血液(骨髓)取材法白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌抽取510mL外周血，置于试管中立刻分离培养。肿瘤细胞原代培养注意