药典附录课件

1、高效液相色谱法2005版中国药典天宇药业2007年4月流程高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实现程序控制。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。适用范围高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定，杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的

2、液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。仪器组成高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。色谱柱 反相 非极性填充剂 常用的有C18 C8 氰基柱 氨基柱正相：极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱：离子交换填充剂；分子排阻色谱：凝胶或高分子多孔微球等填充剂手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。色谱柱填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm（1nm=10A）以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物

3、则应选择孔径在30nm以上的填料。检测器最常用的检测器为紫外检测器UV其他常见的检测器有二极管阵列检测器（PDAD、PAD、DAD）荧光检测器FD电化学检测器ECD示差折光检测器RID蒸发光散射检测器ELSD质谱检测器等MSD检测器紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电

4、化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。紫外检测器紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的检测器，几乎所有的液相色谱仪都配有此类检测器，是一种选择性检测器。紫外检测器灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度的波动不灵敏，适用于梯度洗脱及制备色谱，但是，紫外检测器只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长。紫外检测器工作原理：朗伯-比尔定律，即当一束单色光透过样品池时，若流动相不吸收光，则吸光度（A）与吸光组分的浓度（C）和样品池的光

5、径长度（L）成正比。分类：紫外检测器包括固定波长检测器，可变波长检测器和光电二极管陈列检测器三类。紫外检测器可变波长检测器是目前配置最多的检测器，光路系统类似于分光光度计，一般采用氘灯或卤钨灯为光源，光束经单色器分光后按需要组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。有的还具有双波长比例检测功能，可用于峰纯度检查。二极管阵列检测器是一种光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相当于一个单色器出口狭缝，二极管越多分辩率越高，一般是一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光。DAD的工作原理是：复色光通过样品池被组分选择性吸收后再进入单色器，照射在二极管陈列装置上，

6、使每个纳米波长的光强度转变为相应的电信号强度，即获得组分的吸收光谱，从而获得特定组分的结构信息，有助于未知组分复杂组分的结构确定。许多色谱工作站可将两张色谱图绘在一张三维坐标图上而获得三维光谱色谱图，也可进行峰纯度检查。以峰纯度数值说明某个色谱峰的纯度，数值越高，色谱峰为单峰的可能性越大；数值越低，色谱峰为重叠峰的可能性越大，用于指导色谱分离条件的摸索。随着化学计量学的发展，将色谱信息和相对应的光谱信息相结合，按一定的数学模型处理，能解决重叠峰的识别和定量难题。但DAD检测器的灵敏度比通常的UV检测器约低一个数量级。所以单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UV检测器为好。流动相 由于C18链

7、在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。流动相各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外光光度法进行溶剂检查，应符合规定，水应为

8、新鲜制备的高纯水，可用超纯水器制得或用重蒸馏水。凡规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过适宜的0.45um的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相备用。供试溶液的配制 供试品用规定的溶剂配制成供试品溶液。定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制二份。供试品溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45um的滤膜滤过，必要时，在配制供试品溶液前，样品需经预净化，以免对色谱系统产生污染或影响色谱分离。色谱柱的理论板数（n）24在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同

9、，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2）,按n=5.54(tR/ Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。分离度（R） 2(tR2 tR1) R= - W1 + W2式中 tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽（如 图）。除另有规定外，定量分析时分离度应大于1.5。拖尾因子（T） W0.05h T = - 2d1式中 W0.05h 为5%峰高处的峰宽； d1 为峰顶点至峰前沿间的距离除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。含量定量方法内标法外标法杂质检查法按药品标准规定的方法测定杂质的含量或限量时，如杂质对照品已经建立，则可按规定用上述外标法进行测定；如杂质对照品没有建立，无法获得，或杂质未知，则可按下法测定