分子生物学第七章part1课件

1、1000多种EULEC分别识别不同底物，灵活地降解各种不同的蛋白，协调各种生理活动 被EULEC识别的N-end aa marker of targeting protein Met, Gly, Ala, Ser, Thr, Val 20 hrs (稳定因子) Ile, Glu 30 (不稳定因子) Gln 10 Leu, Phe, Asn, Lys 3 (极不稳定因子)Arg 2Pro 7N-end aa of targeting protein halflife- 决定与Ubiquitin 发生isopeptide bond 的难易程度- 决定被 E3 识读结合难易程度- N 端氨基酸种类

2、对蛋白质寿命的决定性，从原核到 真核生物高度一致 泛素/26S蛋白酶体通路与 植物激素应答 植物抗病反应 植物光形态建成 高等植物有性生殖 植物环境胁迫抗性 Molecular BiologyGibberellin Signaling Pathwaya de-repressible system moderated by DELLA-p degradation induced by GA Induce seed germinationGerminating pea seedGerminating maize seeds GAs control plant growth and developm

3、ent Green Revolution 第一次绿色革命； 粮食作物增产20%Norman E. Borlaug Director of wheat program (CIMMYT)1970 Nobel Peace PrizeGreen Revolution Gene Highly conserved in G.R. gene Arabidopsis: (RGA, GAI, RGL1, RGL2, RGL3) maize : (d8), wheat (Rht) rice : (SLR1), barley (SLN1) grape: (VvGAI1), Brassica rapa (BrRGA1

4、)phosphotyrosine binding domainThe DELLA subfamily of GRAS proteinsChoke back growth A conserved and unique N-terminal domain, named DELLA, after a DELLA motif Wild type DELLA proteins localize in cell nuclei and disappear by GA treatment phosphotyrosine binding domain DELLA domain-mutated are resis

5、tant (G.R.gene ) to GA-induced degradation (GA-insensitive) By using immunoblot analysis and GFP fusion protein analysis, it is shown that GA induces rapid degradation of the wild type DELLA proteins, such as GFP-At-RGA GFP-Os-SLR1 GFP-(rga-17) proteins are resistant to GA-induced degradation+H2O+GA

6、3(rga-17 has the same 17AA deletion in the DELLA region as in gai-1)GFP-RGAGFP-(rga-17)GFP-(rga-17)From Dill et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:14162-14167Scheme of the functional domains of SLR1 for GA signaling pathwayPoly S/T/VFrom Itoh et al., Plant Cell, 2002, 14:57-70 Involvement of the

7、ubiquitin-proteasome pathway in degradation of DELLA proteinsIn response to GA, DELLA proteins are rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathwayUbiquitylating enzyme E3 complex NegativeG.R. gene ？) 6.3.真核生物基因表达与调控的特殊模式 以positive control为主的基因表达调控真核生物染色质的状态对基因表达的调控m5C与基因表达的相关转录后多种方式的加工调节个体发育的阶段

8、调控 真核生物基因表达调控的特异性6.3.1. mRNA的结构对翻译水平的调控Leading seq.(5-Untranslation region, UTR)Cap 具有增译作用Cap + poly(A) 具有增译的协同效应Cap对eIF4b的相对浓度的选择 Shatkin (1976) -m7GpppN(Cap)-AUG flanked seq. effect5 L.S 存在AUG 对第一个AUG密码的起译产生负控效应5-AUG-AUG-NNN- L.S错误起译改变读框降低速率Effect of multiple replicas of the translation initiation

9、 siteimmunoprecipitatd proinsulin-containing polypeptidesthe farthest upstream AUG codon was used which is again consistent with the scanning model-AUG flanked consensus seq (-3A, +4G) Kozak modelKozak (1986) Rat preproinsulin gene under the control of SV40 promoter mutagenized Nt at -3 and +4 posit

10、ion introduction them into monkey cell Effects of single base changes in positions -3(A) and +4(G)Rat preproinsulin gene under the control of an an SV40 promoterKozak Cell 44(31) Jan 1986mutationmutationKozak model35S-MetcapChloramphenicol AcetylTransferase氯霉素乙酰转移酶Higher stability 62 kca/mollower st

11、ability 30 kca/mol1) 30-kcal stem loop only 12 nt downstream of the cap strongly inhibits translation, because it interferes with binding of the 40S ribosome and factors at the cap. 2) 62-kcal stem loop placed 71 nt downstream of the cap completely blocked appearance of the CAT protein.Why?6.3.2 染色质

12、重建对基因表达的控制表观遗传及其分子机制Epigenetic and Molecular MechanismEpigenetic inheritence:The ability of different states, which may have different phenotype consequences, to be inherited without any change in the DNA sequence.在DNA序列没有发生任何改变的情况下，不同表型效应具有可以遗传的能力（Ww in euchromatin）w Ww Red eye （W (near heterochrom

13、atin) be silenced WwWw white eye Position effect of variegation in Drosophila eyes Epigenetic phenomenaSpot eye Cellular Memory : Arabidopsis VernalizationEpigenetic phenomenaOne X chromosome is inactived at randomparental imprinting BCDAAllelic interaction (paramutation)- Position-effect variegatio

14、n - Inactivation of chromosome X- Cell-type conversion- Allelic interaction (paramutation)- Transgene silencing- Parental imprintingCell memory: VernalizationHeterosis！？Epigenetic phenomena染色质结构的调整核小体的松弛组蛋白的乙酰化组蛋白的甲基化沉默子.染色质重建 Chromatin RemodelingEpigenetic and Molecular Mechanism Basic unit of chro

15、matin Nucleosome (-body 200bp)Histone 1 + linker DNA of 20-60bp (diff. From diff. creature)2 H2A H2B H3 H4 Octamer + core DNA of 146 bp1.75 cycle 染色质结构6nm11nm30 nm10nm fibreHeterochromatinEuchromatin组蛋白中富含 Lys+, Arg.+ 量大， 进化保守， 与DNA 无专一性结合区N端外露Arg与DNA14个小沟结合富含Lys的 N端（特别是H4）能保证Histone间的稳定性和与DN

16、A的结合N端磷酸化、乙酰化等能降低组蛋白正电荷，使组蛋白间以及与DNA的结合状态发生 松弛Histone acetyltransferase (HAT) Histone deacetylase (HDAC)Histone methyltransferase (HMT)LysArgLysSerLysHistone Codon Histone code组蛋白一个位点的修饰可以激活或抑制另一个位点的修饰，这种信号的组合可以寓意染色质的类型与性质。这种组合也被称为组蛋白密码 chromatin 状况与基因表达相关Euchromatingene onHeterochromatingene

17、offHeterochromatin；Constitutive Heterochromatin: 组成型异染色质除DNA复制以外，一直处于高度致密的固缩状态，DNA从不转录（高度重复序列，着丝点，端粒等） Facultative Heterochromatin: 特异型异染色质有时处于异染色质状态，有时为常染色质状态转录活化区/ 非转录活化区 chromatin 的结构差异 DNaseS Nucleosome incomplete No Histone1 in linker DNAin transcriptional activated region 表达非常活跃的rDNA 区无核小体 结构

18、凡被Trans-factor 结合的区域 均能阻止nucleosome再形成 H2A、 H2B,、H3、 H4 acetylated降低组蛋白的正电荷组蛋白解聚-body松弛80%H3, H4 乙酰化 丁酸钠（去乙酰化酶抑制剂）Hela cell基因高效表达Pazin Kadonaga 1997 Cell. 89: 325-328 从酵母中分离出 组蛋白去乙酰化酶AB 以及相应的催化组分 HDAC1RPD3 HDAC1RPD3基因突变导致H3/H4超乙酰化 引起基因高效表达Over acetylationModel for participation of histone deacetylas

19、e in transcription repressionhistone deacetylase cooperator HDAC1 Nucleosome relaxedNucleosome reconstructedHistone methylation causes inactive chromatinHeterochromatin protein 1 分离得到与甲基化DNA结合 抑制转录的MeCP2Jones P.L. 1998. Methylated DNA and MeCP2 recurit histone deacetylase to repress transcription .

20、Nature Genet. 19: 187-191组蛋白去乙酰化酶A (dHAT-A)dHAT-A的催化因子(SIN3)MeCP2(m5C结合蛋白)complexMeCP2SIN3dHAT-AMeCP2与m5C结合阻止TFII与DNA结合Histone去乙酰化作用, 重建核小体抑制基因表达Histone methylation causes inactive chromatinHeterochromatin protein 1HP1 may propagate heterochromatinInactive Chromatin. m5C对基因表达的调控a) m5C是真核生物 DN

21、A中的主要修饰成分 多发生在CpG序列中,不同细胞间m5C 相差甚大胚胎细胞与特化体细胞相差106b) m5C对基因转录抑制的表现 DNA大沟内的m5C 影响与T.F.间氢键的形成 DNA大沟内的m5C 导致空间拥挤,破坏构象的平衡 使B-DNA Z-DNA T.F. 结合空间的改变 染色质重建 降低转录因子与DNA的结合Genome and gene imprint in Eukaryots一定组织和细胞中，某些基因在DNA水平上的表达程度及表达时空受到一种“后成修饰，表观修饰”（epigenetic modification 相同的DNA结构，不同的表型）机制控制。使仅来自双亲中某一亲本的

22、基因得以表达 。这一现象也称为“基因组印记”DNA 的甲基化、异染色质化是“imprint” 的重要机制染色体区域性印记中相邻印记基因具有“相反”的印记作用模式 父本基因印记 母本基因印记 合子及幼胚期，DNA去甲基化程度高，gene imprint被抑制，表现了细胞的“全能性” Genome / gene imprint表现的特点 Genome imprint具有染色体区域性或整体性 印记现象具有组织细胞的特异性 基因印记的发生常与该基因的编码区， 启动子区及其上下游的CpG序列甲基化相关Genome / gene imprint表现的特点 印记效应会因去甲基化而消失 (水稻白叶枯病成株抗性

23、？)One X chromosome is inactived at randomTwo X chro. Euchromatin in 16 day precursor cellOne X chro. inactived at randomVariegation Prader-willi症(PWS)：肌肉无力、矮小、神经疾病 Argelmen症（Ag）：平衡性差、过分兴奋与发笑 共同的病因：15q11-q13 缺失，基因型相同子女的 父 父染色体 母 母 病症： Ag PWS 母本基因印记 父本基因印记 被异染色质化的X染色体 常染色质化 导致雌性哺乳动物宫颈癌，胃癌双重遗传病因：缺失 / 印

24、记3 types of modification affect chromatin甲基化的CpG序列可招募组蛋白去乙酰化酶，抑制基因的表达。 Vernalisation植物低温春化现象的分子机理AfterVernalization FLC Leafy MADS FloweringFLC methylationN5-C 的春化效应Without Vernalization FLC Leafy MADS Flowering低温春化处理消除对MADS Box基因表达的负控制效应Vernalization低温春化 引起脱乙酰化、甲基化修饰 导致异染色质化Regulation of the floral

25、 repressor FLC by histone deacetylation (FLD)yesNoNoACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC mut.- Chromatin structureand remodeling- DNA methylation- Histone modification (Ac & Me)- Relationship between DNA Me and HistoneMe - Creation of repressive domain - ncRNA- Heterochromatin formation Chromati

26、n modification & remodeling as the epigenetic basis No-coding RNA ncRNA 看家RNA rRNA，tRNA，UsnRNA，telomere RNA. 调节RNA microRNA（miRNA），siRNA， anti-sense RNA.What is microRNA?MicroRNAs are a newly identified class of small single-stranded non-coding RNAs;MicroRNAs regulate their target genes via two main

27、 mechanisms: target mRNA cleavage translational repression.The characters of miRNALength: 18-25 nt;Single-strand;Conserved among species;Encoded by internal DNA sequences, which are located in the whole genome, mostly in the interval regions of coding genes, centromeres, or, occasionally in the intr

28、ons;Temporally and tissue-specifically expressed The biogenesis of miRNAReview: Geogre S Mack, Nature Biotech., 2007dsRNA由Dicer加工成21NtsiRNA，在RDRP的作用下可以扩增，siRNA与靶mRNA来源与同一基因60100nt，3具有2Nt突起茎环结构的premiRNA，由Dicer加工成一条双链的21miRNA，与靶mRNA来自不同的基因 siRNA miRNA来源于mRNA，病毒RNA，转座子，外源RNA来源于基因组内的microDNA、剪切的intron.（

29、内源性）与靶基因可不完全配对，因此可调控若干不同的基因在近缘物种间具有较高的保守性与靶基因完全配对，专一性强不同内源siRNA具有较大的差异与mRNA结合，或剪切mRNA，抑制翻译，沉默基因表达(特别是转录因子)。 进入RISC体系，在转录后水平上沉默基因表达进入RISC体系降解靶mRNA，转录后水平上沉默基因表达，RNAi works by generating siRNADicerRISC置换Lin14蛋白调节秀丽新线虫的幼虫发育，但受lin4基因的控制Lin4 编码22Nt的microRNA, 与Lin14mRNA3端非翻译区出现7次重复的10Nt序列互补，抑制Lin14蛋白的翻译 co

30、mmon mechanism for microRNA, RNAi and heterochromatin formation . Programmed Cell Death (PCD) and development2002 Nobel Prize John Sulston USA Sydney Brenner Japan 田中 耕一 H. Robert Horvitz Switzerland 细胞的“生”发育、分裂、繁殖、分化、成熟细胞的“死”. ?- 高等生物的诞生发育成长死亡 即寿命是生物固有的特征- 死亡是生物体不可缺少的生命内容 是生物借以存活的需要 并贯穿寿命的全部

31、周期中PCD gene 的发现与克隆人类长寿癌症发生提高产量- 细胞死亡的发生及过程是在长期进化中已形 成的遗传程序（PCD） 这一程序表达的失控个体发育受阻 、病变、 畸形、蹼趾、有尾.癌症（白血病）-细胞周期变短, 增殖过快, pcd失控, 细胞死亡速率变低细胞增殖与细胞死亡平衡失调癌症的发生-皮肤, 指(趾)甲(细胞从有生命经PCD向无生命的转化)pcd无皮，无鳞，无爪失去保护与防御功能-pcd 白细胞不分化，不死亡，不代换41天51天在细胞自身遗传程序的控制下，有关基因的正常表达，细胞裂解成apoptotic bodies, 逐渐死亡的现象a) PCD的概念细胞的死亡； necrosi

32、s (accidental cell death) 坏死外因细胞急速死亡，病变死亡 Programmed Cell Death (PCD)或 Apoptosis 凋亡 细胞程序性死亡Apoptosis细胞变园变小与邻近细胞脱离胞浆浓缩染色质凝集成月牙状内质网扩张成泡状并与膜融合PCD的细胞学特征膜内陷，细胞呈沸腾运动，细胞自行解体成若干有膜包围，内容物不外溢的凋亡小体被巨噬细胞吞噬核内DNA被核酸酶在核小体单位间降解电泳检测呈 ladder of 180-200bp apoptotic bodiesApoptosis: active cell death; cell suicideNecros

33、is: accidental cell death; cell murder images of nuclei from apoptotic and necrotic cells 促进PCD的基因Ces (cell death specification)细胞凋亡特异基因p53抑癌基因Caspase（半胱氨酸酶家族，蛋白降解途径）. 抑制PCD的基因LAP (inhibitor of apoptosis) 凋亡抑制剂基因Cystatin.b) 与PCD相关的基因Caspase, p53 pathwaycystatinBI-1植物的PCD表现与机制 植物抗病的过敏性反应Hypersensitiv

34、e Response PCD枯斑的形成 花药的发育（CMS？） 木质部的分化 绒毡层的退化 禾本科植物胚乳的发育 缺氧条件下诱导的玉米根部通气组织的形成与根冠的形成具有与动物细胞相似的 细胞学表型与生化特征植物PCD的相关基因与机制 半胱氨酸酶家族（Caspase） 衰老叶片，果实，花器发育中木质部的形成Caspase 乙烯在PCD中起重要作用 缺氧条件下，乙烯诱导玉米根部胞内Ca+增加 气生组织的形成 小麦胚乳形成中，乙烯调节DNA降解 acd1,acd2（accelerated cell death）基因 Acd负控制Arabidopsis HR诱导的 PCD过程-植物抗病的PCD表现 A

35、cd (Accelerates Cell Death) Lsd (Lesions Stimulating Disease Resistance)Programmed Cell Death Neg. controlConstitutivePathogenPlantPCD 负调控关闭PCD系统表达Oxidative burstH2O2 , -OH , O-22 升高NADPHoxidaseAcd/Lsd repressor 失活枯斑停止扩大高浓度H2O2 消失枯斑形成限制病原物扩展H2O2 induced cytoplasm shrinkage, a typical marker of plant

36、 PCD.在发育进程中，PCD何时启动？如何决定 某一细胞执行PCD?机体内是否存在真正杀手基因（killer gene）?Killer只在PCD细胞中表达！其产物可使细胞走向死亡！PCD的信号，传递？ Prok.与Euk.基因结构及表达的差异 Repetitive gene Overlapping gene Retro-transposon Non-coding region (function?) Splitting geneEukaryote ProkaryoteDNA，RNA, protein DNA + histone chromatin Naked DNA and chromati

37、n Remodeling Enhancer & Silencer Attenuater Monocistron polycistron (operon) m5C gene off acetylationphosphorylationmathylation glucosylationT.Factive formEukaryote Prokaryote Post-transcription Transcription & translation RNA processing Synchronizely Housekeeping gene(constitutive)Basic promoter +

38、T.F. Luxury gene (inducible) 多种组合的Trans-Factor Multiple gene familyCluster gene Quantitative Trait loci Positive control 严谨性，专化性 ，复杂性single gene(cAMP + CAP) site +UPE + pribnow box 单一类型保险性 Negative controlEukaryote Prokaryote 多细胞生物单细胞生物 细胞分化, 组织特化, 个体发育结构简单 遗传，代谢复杂遗传，代谢简单 线粒体，叶绿体质粒（plasmid）Eukaryote

39、 ProkaryoteCell 细胞膜外界信息的感知与传递细胞信号传递细胞核第7 章 基因突变与交换 Gene Mutation &Crossing-Over7.1. Point mutation 的类型 7.2. 突变发生的机理7.3. 保证遗传稳定的机制7.4. 基因重组交换的分子生物学7.1. Point mutation 的类型 dNt insertion or deletion Indel = 3 dNt n Amino acid = 3 dNt Framshift conversion (取代)transition(转换) Py Py Pu Pu transvertion(颠换)

40、Py Pu conversion effect -Samesense mut. GAA(E) GAG(E) -Missense mut. GAA(E) AAA(K) -Nonsense mut. GAA(E) TAA(stop) 南京大学田大成等发现的遗传突变新效应 Nature，doi:10.1038/nature07175，Dacheng Tian，Jian-Qun Chen第一，基因组各区域的突变率很不相同， Indel的数量和密度是度量自发突变发生位点的重要标准；第二，生物多样性的最初变异主要源自Indel；第三，自然选择在很大程度上是通过对Indel的选择而实现; 突变的表达类型 -

41、获得突变型是遗传学研究的重要前提 -非条件型突变； allele in DNA level (RFLP, RAPD) allele in phenotype (红花/白花，糯/非糯) 条件型突变； 突变的表现 = 突变基因型 + 诱导条件 （光，温敏感不育，Ts, su-） 突变的表达类型 无效突变 Null mutation： 完全消除了基因功能的突变（缺失） 功能丧失型突变（loss-of-function mutation） 无效突变或其他阻止基因功能的突变 功能获得型突变（gain-of-function mutation） 突变使蛋白质获得新的功能 沉默突变（silent mutat

42、ion） 没有明显表型效应改变的突变 突变的表达类型 DNA level RAPD F1 ? RFLP F1 ? Protein level F1 ? 7.2. 突 变 发 生 的 机 理 (自发突变，诱发突变) 7.2.1. 自发突变 . 碱基异构式引起DNA复制过程的错误 a) 碱基异构式 A(amino) A(imino) C(a) C(i) G(keto) G(enol) G(k) G(e,i) T(keto) T(enol-2) or T(enol-4) A(a)A(i)C(a)C(i)G(k)G(e)G(e,i)T(k)T(2e)T(4e)b) 碱基异构式引起DNA复

43、制的错配 碱基异构式引起DNA复制的错配 碱基异构式引起DNA复制的错配 A(a) T(k) G(k) C(a) 正确配对 错误配对 G(k) T(e) A(a) C(i) A(i, anti) A(a, syn) A(i, anti) G(k, syn) G(e,i, anti) G(k, syn) G(e,i, anti) A(a, syn) A(i) C(a) G(e) T(k) C(i) A(a) T(k) A(a, anti) T(k, anti) C (a, anti) A(a) A (a, anti) 碱基异构式引起DNA的错配突变 C(i)C(a)G (k, syn) G (k