基因工程工具酶

1、关于基因工程工具酶第1页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”“分子运输车”“分子缝合针”基因工程的工具酶 限制性内切酶I型限制性内切酶II型限制性内切酶III型限制性内切酶 DNA连接酶E. coli DNA连接酶T4 DNA连接酶 载体克隆载体表达载体第2页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四一、基因工程的工具酶1、工具酶的概念与种类工具酶：凡是基因工程中应用的酶类通称为基因工程工具酶。修饰切连按用途为三类限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA修饰酶第3页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四2、限制性核酸

2、内切酶(restriction enzyme) （1）限制性核酸内切酶的概念核酸酶：切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶。 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。第4页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（2）限制性核酸内切酶的发现for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular geneticsThe Nobel Prize

3、in Physiology or Medicine 1978Werner Arber Switzerland 1929Daniel Nathans USA 19281999Hamilton O. Smith USA1931第5页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 20世纪60年代在研究细菌的限制和修饰现象时被Linn和Arber发现。寄主限制与修饰现象(Restriction and modification )在E. coli K上生长的噬体则表示为（K）。实验表明，用这种（K）噬菌体感染E. coli B，形成噬菌斑的效率就很低因此（K）噬菌体受到了B菌体的限制。 11

4、第6页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。限制（Restriction）第7页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。修饰（Modification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基第8页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是restriction,修饰modification,所以把这一系统

5、叫做：R/M体系。限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶。限制与修饰存在两方面的作用：一是保护自身的DNA不受限制，即不被切割；二是破坏外源DNA使之迅速降解。第9页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（3）限制性核酸内切酶的种类第10页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（4）限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株Hind III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EcoR IEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号 若种名头2个字母相同则其中一个

6、可用种名的第一和第三个字母。第11页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（5）限制性核酸内切酶的特征特异的识别序列、严格切割位点EcoR I的切割位点EcoR I的识别序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5Cleavage sites识别-8个相连的核苷酸 4 个碱基识别位点：Sau3A GATC 5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG Nci CCSGG 6 个碱基识别位点：EcoR GAATTC识别序列与DNA的来源无关识别序列越长切割频率越小识别序列越短切割频率越大第12页，共76页，2022年

7、，5月20日，5点55分，星期四识别序列特点 回文结构(palindrome)EcoR I5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5 5 GG-A-T-C-C 3 3 C-C-T-A-GG 5 BamHI居 然 天 上 客 客上天然居切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧Sau3A 5 GATC 3EcoR 5 CCWGG 3 Nci 5 CCSGG 3 EcoR 5 GAATTC 3 第13页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧Sau3A 5 GATC 3EcoR

8、 5 CCWGG 3 Nci 5 CCSGG 3 EcoR 5 GAATTC 3 限制酶切后产生两个末端末端结构：-和-末端种类：平头末端和黏性末端 -端突起和-端突起第14页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四PstI等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5第15页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四-端突起 Pst I 5-CT

9、GCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5-端突起 EcoRI 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5平头末端（Blunt ends） SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5第16页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四粘性末端的意义ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。连接便利粘性末端标记凸出的5 末端可用D

10、NA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第17页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（6） 同位酶、同尾酶与同裂酶同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。 SmaI CCCGGG XmaI CCCGGG同尾酶：来源各异，识别序列不同，但切割后产生相同的黏性末端。 Sal I G TCGAC Xho I C TCGAG同裂酶：能识别相同序列，且识别位点与切割位点均相同，但来源不同的两种或多种限制酶。 SstI CCGC GG Sac

11、I CCGC GG第18页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（7）大部分II 型核酸内切酶需要的反应条件不同的酶使用不同的类型反应体系Tris-HCl50 mM pH 7.4MgCl210 mMDTT/BSA1 mMVolume20 - 100 lTep. and Time37 , 1 - 1.5 hr1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 g 标准DNA所需的酶量第19页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（8）影响核酸内切限制酶活性的因素 DNA的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，

12、1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间第20页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基第21页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四酶切消化反应温度不同酶之间所需最适反应温度不同，且彼此间有

13、相当大的变动范围。大多数酶标准反应温度都是37。 例外：Sma 25Apa 30Mae 45Taq 65第22页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四DNA的分子结构DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。 第23页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-

14、HCl，-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。酶切时间 通常酶切时间12小时，但大多数酶的活性可维持很长时间，我们可以酶切过夜。第24页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性（Star activity）现象，即限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与之特异型识别顺序类似的序列，降低酶切的特

15、异性，这种现象称为星号活性。非适宜环境EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3第25页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四抑制星号活性的方法 1)尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免 过度消化以及过高的甘油浓度。 2)尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。3)将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子 强度影响）。 4)将反应缓冲液的pH值降到7.0。5) 二价离子用Mg2+。 第26页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四不同的

16、酶生产厂家适合各种不同反应的缓冲液TakaraNEBLTI (Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI第27页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四3、 DNA连接酶（ligase）（1）DNA连接酶的概念 是指利用ATP分子中的-磷酸基团为能量，通过催化两条并排DNA链的5-磷酸基团和3-羟基之间，形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的特异的核酸酶。ATP依赖的DNA连接酶NAD依赖的DNA连接酶大多数原核生物DNA连接酶真核生物和病毒DNA连接酶，如T4DNA连接酶、真核生物DNA连接酶、类 型第28页，共76页，2022年，5月20日，5点55分

17、，星期四（2）DNA连接酶的特性DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的必须是双螺旋DNA的一部分。第29页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四DNA连接酶只能连接DNA双螺旋骨架上的切口，而不能连接缺口。第30页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四T4 DNA连接酶用途： 1）互补粘性末端的连接; 2）平头末端的相连； 3）一条带有切口的双链DNA分子； 4） DNA杂合体中链上的切口。E.coli DNA连接酶用途：1) 互补粘性末端的连接;2) 一条带有切口的双链DNA分子。第31页，共76页，2022年，5月20日，5点

18、55分，星期四（1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP复合物，同时释放出PPi或NMN；（3）连接机理（2）激活的AMP结合在DNA链5端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键；（3）与相邻DNA链3羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。第32页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（4）不同末端连接策略单酶切产生的相同黏性末端第33页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四双酶切产生的黏性末端第34页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四双酶切产生不同的5突出末端第35页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四

19、双酶切产生不同的3突出末端第36页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四双酶切产生的5突出末端和3突出末端第37页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四平切产生的平末端第38页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四平末端DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单

20、价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM第39页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法 同聚物加尾法 第40页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四衔接物连接法 衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 第41页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 第42页，共76页，2022年，

21、5月20日，5点55分，星期四Tris-HCl50-100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1mMDTT5 mMVolume10 - 20lTep. and Time4-15 , 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 g DNA（Hind III片段）所需的酶量（5） DNA连接酶的反应条件第43页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。插入片段与载体的浓度比例 反应温度插入片段浓度高，至少21。一般1416（6） 影响DNA连接反应的因素

22、平末端DNA分子的连接最适反应的酶量为12个单位， 粘末端的连接，酶量为0.1个单位较好。 DNA连接酶用法与用量第44页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四4、 DNA聚合酶（ligase）（1）DNA聚合酶的概念和类型DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3 -OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶的类型 根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类：（1）依赖于DNA的DNA聚合酶；（2）依赖于RNA的DNA聚合酶。第45页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四大肠杆菌DNA聚合酶 Kleno

23、w fragment (克列诺酶)T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修饰过的T7 DNA聚合酶 逆转录酶（2）常见DNA聚合酶及共有特点第46页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;需要模板和引物的存在;不能起始合成新的DNA链;催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端;催化DNA合成的方向是53。 共同特点主要区别持续合成能力和外切酶活性不同 。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 第47页，共76页，202

24、2年，5月20日，5点55分，星期四DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较第48页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（3） DNA聚合酶I大肠杆菌的DNA聚合酶I是一条约1000个aa 的多肽链形成的单亚基蛋白，分子量109Da.三种活性： 聚合酶活性：将4种脱氧核糖核苷酸聚合为新的DNA链。 53外切酶活性:

25、位于N端 3 5外切酶活性: 防止错配。第49页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有3OH游离端的引物 DNA模板DNA聚合酶I（Pol I）的聚合活性反应条件-OH5 3 dNTPs第50页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四标记 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。用DNA聚合酶I 制备探针已知序列的核酸片段显示位置与互补的待测序列杂交第51页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四标记已知序列的核酸片段 探针的标

26、记方式标记已知序列的核酸片段5 3 标记一端带有放射性的已知序列的核酸片段全序列标记第52页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 DNA聚合酶I 对探针序列的标记切口转移法(nick translation )：放射性同位素标记：DNA聚合酶I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。第53页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 第54页，共76页，2022年，5月20日，5

27、点55分，星期四纯化的DNA片段DNase I 制造单链切口DNA Pol I 进行切口转移一种-32P-dNTP和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记第55页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（4） Klenow fragment用枯草杆菌蛋白酶处理Pol I可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 605个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol 第5

28、6页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 3端补平5 5 klenow补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。klenow主要用途第57页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四3隐蔽末端的DNA片段Klenow fragment补平根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs末端标记的DNA 限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBa

29、mH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h第58页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物第59页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四（5）逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。a、鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶b、莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶主要种类53聚合酶活性53外切酶活性35外切酶活性RNase H活性末端转移酶活性酶活性第60页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四逆转录酶

30、的用途 合成cDNA以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18反转录酶Mg2+ dNTP3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTTTTTT3cDNA第61页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四 合成cDNA双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链35mRNA RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。53cDNA35mRNA53cDNA反转录酶53cDNAklenow35mRNA第62页，共76页，20

31、22年，5月20日，5点55分，星期四（6）Taq DNA聚合酶1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。（天然酶）Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。第63页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四酶活性与热稳定性酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg，Ta

32、q酶的浓度通常为12.5/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温 在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。 PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 第64页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓度非常敏感。Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+ 浓度，

33、优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0 mmol/L。适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%。离子依赖性第65页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四TaqDNA聚合酶具有53 聚合酶活性和53外切酶活性，而无3 5外切活 性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性.忠实性Taq酶的最适温度最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb第66页，共76页，2022年，5月20日，5点55分，星期四5、 DNA修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种